果蝇细胞内共生菌Wolbachia研究进展

张广，陈雨，王蓓蕾

(1. 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650091； 2.云南大学 生命科学学院，昆明 650091；3. 甘肃农业大学 植物保护学院，兰州 730070)

1924年，Hertig和Wolbach[1]在尖音库蚊(Culexpipiens)生殖组织中首次发现Wolbachia，后被命名为Wolbachiapipient[2]。由于Wolbachia能显著影响宿主适合度并广泛分布在节肢动物内，20世纪70年代引起广泛关注。

Wolbachia主要通过宿主母系生殖细胞传递给子代，并诱导细胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility, CI)、孤雌生殖(parthenogenesis)、杀雄(mail killing)、雌性化(femalization)和增强雌性生殖力等[3-4]，从而影响宿主生殖活动。此外，Wolbachia对宿主寿命、嗅觉反应、免疫力及干细胞增殖等也产生影响[5-8]。近年与Wolbachia相关的研究不断被报道，例如把Wolbachia应用于控制蚊虫传播疟疾、登革热等疾病[9]；Wolbachia与宿主相互作用中，交尾模式影响宿主体内Wolbachia密度动态[10]。

近年果蝇种内或种间水平的Wolbachia相关研究大量被报道。但国内外尚未见对此有专门的总结和评述。因此本文对果蝇细胞内共生菌Wolbachia的基础生物学、分布、对果蝇生殖活动的调控等进行评述，以及对果蝇相关的Wolbachia研究现状及趋势进行简要讨论，旨在为相关研究提供一定参考。

1 Wolbachia的普遍性及在果蝇中的发现

2015年Weinert等[11]报道52%的节肢动物被Wolbachia感染。据推测感染Wolbachia的昆虫有150～500万种，大多数存在于宿主精巢和卵巢组织细胞质内，在马氏管、靠近体腔的肌肉组织、血细胞、血淋巴和神经组织中也有发现。

1986年，Hoffmann等[12]在雌性D.simulans中首次发现果蝇体内存在Wolbachia。1997年Min & Benzer[13]报道果蝇脑内大量积累Wolbachia，并发现Wolbachia的wMelPop株系感染D.melanogaster，会导致宿主寿命严重缩短的现象。近年果蝇细胞内Wolbachia的研究较多，如Richardson等[14]进行D.melanogaster内Wolbachia群落基因组分析，结果显示D.melanogaster的mtDNA谱系关系与体内Wolbachia的谱系关系是一致的，从而揭示单系祖先种Wolbachia通过宿主母系细胞质严格传递到子代。Siozios等[15]利用wMel、wRi、wAna、wWil和wSim菌株基因组序列作为探针，在D.suzukii基因组序列中检索到与Wolbachia匹配的序列，也检索到Wolbachia菌株中新的wSuzi基因组序列；Kriesner等[16]比较分析北美洲、非洲和欧亚大陆D.melanogaster中Wolbachia的感染频率，并调查澳大利亚Hawthorn、美国南波特兰和英国爱丁堡三地区寒冷条件下，自然感染Wolbachia对休眠期D.melanogaster适合度的影响。国内研究者利用Wolbachia的16S、rDNA和wsp基因特异引物对D.suzukii的7个地理种群(中国5个、韩国和美国各1个) 的Wolbachia进行检测，发现我国5个种群的Wolbachia感染率为36.7%～80.0%，均属于A组[17]。熊恩娟等[18]对我国湖北武汉、云南六库和天津3个地区D.melanogaster中Wolbachia进行研究，表明3地区感染的Wolbachia都属于A 组，感染的Wolbachia序列类型不同，存在一定差异；对果蝇生殖活动分析，发现湖北武汉和天津果蝇中Wolbachia能引起强烈的CI，而云南六库果蝇中Wolbachia引起的CI 强度相对较弱。武汉果蝇中Wolbachia不能完全挽救天津果蝇中Wolbachia引起的CI，而天津果蝇中Wolbachia也不能完全挽救武汉果蝇中Wolbachia引起的CI。此外，Wolbachia在果蝇整个大脑内的分布不均匀，可通过不同的模式在细胞间进行转移[19]。雌果蝇体内Wolbachia能活跃地从腹腔背部区域向生殖腺移动，穿过多个组织界面最终建立宿主生殖细胞的干细胞龛[5,20]。

2 Wolbachia在果蝇中的传播方式

2.1 垂直传播

Wolbachia是一种专性细胞内共生菌，在宿主间有不同的传播方式，其中通过卵细胞质在宿主世代间的垂直传播(vertical transmission)是Wolbachia主要的母系传播模式[21]。此模式受不同因素影响，Frydman等[20]认为长期感染Wolbachia的果蝇，卵巢躯体干细胞龛中有大量Wolbachia，可能会增强Wolbachia在果蝇中垂直传播的效率。也有研究表明Wolbachia在D.melanogaster种内能利用宿主肌动蛋白进行有效的母系传递[22]。

2.2 水平传播

1995年，Werren 等[23]首次报道包括D.simulans在内的一些昆虫种间Wolbachia的水平传播(或横向传播，horizontal transmission)；近年Bennett等[24]对夏威夷4个感染Wolbachia的双翅目昆虫家系进行筛选，发现果蝇科Wolbachia的感染占18%。进行wsp系统发育分析，发现果蝇物种如远缘物种D.eurypeza和D.nr.basimacula、广布种D.dasycnemia，D.redunca和D.prodita等物种间存在Wolbachia水平传播。

自然界Wolbachia水平传播途径非常复杂，已报道的有同种宿主不同个体间的水平传播、系统发育关系较远昆虫种间的水平传播及昆虫与其他节肢动物间的水平传播。这3种途径在传播过程中可能受到诸如昆虫迁飞、非适龄交配、极端高温等因素影响[25]。

目前不同宿主间负责内共生菌传播的生态分子机制尚不清楚[26]，近年研究也取得了突破性进展。Vijendravarma等[27]发现D.melanogaster幼虫有噬食同类(cannibalism)的现象，而Faria[26]发现噬食同类是Wolbachia在果蝇个体间水平传播的机制之一。Brown & Lloyd[28]还发现了果蝇通过体外寄生的螨虫在个体间水平传播Wolbachia的证据。

3 Wolbachia感染对果蝇的影响

大量文献揭示了Wolbachia通过不同方式影响或调控宿主果蝇的生殖活动，包括诱导细胞质不亲和、诱导杀雄。此外，Wolbachia也对宿主果蝇寿命、嗅觉反应等产生影响。Wolbachia诱导的孤雌生殖(parthenogenesis induction, PI)与CI相似，发生在胚胎发育的早期，但此现象仅发现在一些寄生蜂、螨类和蓟马中，果蝇研究中未见报道。雌性化(feminization)也是Wolbachia影响宿主的一种重要方式，最早在等足目昆虫中被发现，后来在鳞翅目和膜翅目中也发现了此现象，但迄今未见Wolbachia引起果蝇雌性化的报道。

3.1 诱导细胞质不亲和

细胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility，CI)是Wolbachia引起的宿主中最普遍的一种表型，当感染Wolbachia的雄性宿主和未感染Wolbachia或感染不同品系Wolbachia的雌性宿主交配后，受精卵不能正常发育，在胚胎期死亡的现象。目前对CI机理的探索主要集中在细胞学水平上，而分子机理上的探索则在转录组、基因组和miRNA水平上对部分昆虫展开研究。但CI受到宿主遗传背景、Wolbachia株系、环境等因素的影响[29]。

目前Wolbachia引起CI的分子机制尚不明确[30]，但“锁-钥匙”模型(1ock and key model)、“移除-归还”模型(titration-restitution model)和“减速”模型(slow-motion model)可在一定程度上解释自然界中Wolbachia引起的CI表型[31]。“锁-钥匙”模型认为Wolbachia对父系精子进行修改(上“锁”)，使父系染色体不能正确表达而导致发育停止，胚胎死亡。但如果卵细胞中存在相同类型的Wolbachia(锁的“钥匙”)，能使父系染色体功能得到恢复，胚胎正常发育。该模型与1998年Bourtzis等研究的“修饰”(modification)和“营救”(rescue)功能不同，是由不同基因决定的。“移除-归还”模型即Wolbachia锁定宿主的某些蛋白质并与其结合，从成熟的精母细胞中共同移除，使父系染色体不能正常发育。但如果卵细胞中存在相同的Wolbachia，可使受精后缺失的染色体蛋白质得到归还，胚胎由此得以正常发育。“减速”模型认为雌性可产生与父系染色体结合的减速因子，使父系染色体发育减缓，不能与母系染色体发育同步，最终导致胚胎发育终止；倘若父系和母系感染同种类型的Wolbachia，二者在发育上仍可保持同步，胚胎能够正常发育。以上3个模型都存在缺陷，但把CI机制分为两部分来解释，使研究者更容易理解。

研究者们近年来对Wolbachia引起果蝇的CI进行了一系列研究。Awrahman等[29]通过不同龄期处女D.simulans交尾实验，发现感染Wolbachia的D.simulans交尾率比未感染的高，且交尾过程中与未感染的D.simulans相比，感染非处女雄性D.simulans精子转移较少；也进一步揭示D.simulans的年龄、交尾史和Wolbachia共同对CI产生影响。Richardson等[32]在澳大利亚热带果蝇D.pandora种群实验中，调查Wolbachia诱导的CI和杀雄两种表型，发现D.pandora种群内稀有的杀雄菌不会引起CI，且在D.pandora种群中共存杀雄菌株和CI菌株。Cooper等[33]对D.yakuba复合种中D.yakuba、D.santomea和D.teissieri三个物种长期研究后首次发现Wolbachia能引起种内或种间CI，且Wolbachia感染的雌果蝇可能对种内或种间CI有保护作用。另外，Wolbachia感染导致D.melanogaster体内mRNA和zipper基因表达上调，并诱导无Wolbachia感染的转基因D.melanogaster的zipper过度表达，导致产生类似CI关联的受精缺陷的父系损伤，表明Wolbachia能影响D.melanogaster精子发生过程中细胞骨架活动的关键调节因子的表达[34]。Yuan等[30]对Wolbachia诱导D.melanogaster的 CI分子机制进行定量蛋白质组学分析，指出改变精液蛋白表达可能是Wolbachia诱导CI的分子机制之一。Xi等[35]研究果蝇S2细胞株与Wolbachia的相互作用，发现Wolbachia还可调节宿主热激蛋白的表达，从而诱导CI发生。此外，对Wolbachia影响果蝇Hira基因表达水平的研究也表明该基因与Wolbachia诱导的CI现象有关，由此推测Wolbachia感染导致雄性果蝇Hira基因表达下调可能是引起CI的分子机制之一。

3.2 诱导杀雄

杀雄(male-killing)是指节肢动物中通过细胞质遗传的某些微生物引起宿主雄性胚胎或幼体的死亡。目前由Wolbachia引起的杀雄表型在昆虫研究中相对比较普遍。果蝇研究发现了由Wolbachia引起的杀雄现象[36]，但并不多见。杀雄作用有早期杀雄和晚期杀雄两种形式，前者发生在胚胎发育阶段，后者发生在幼虫阶段或蛹期，且幼虫阶段或蛹期的杀雄作用中，雄性致死可增加Wolbachia水平传递的机会[37]。

两种杀雄形式在果蝇中均有发现[38]。果蝇种群水平研究揭示，在竞争激烈、近交退化、相互作用的姊妹种中，Wolbachia感染导致的杀雄作用在种群中可能是最易扩散的[39]。宿主可能以与杀雄表型无关的方式从Wolbachia中直接受益，因此，诱导杀雄的细菌在果蝇物种中也相对更常见[40]。有研究表明部分杀雄可以达到很高的频率，从而改变宿主的交配系统，以适应雄性个体缺乏[41]。此外，宿主的杀雄抑制基因型可以在感染群体中快速蔓延，对杀雄作用产生影响，果蝇这方面的研究还有待挖掘。

诱导杀雄的细胞学机制研究近年持续深入。Riparbelli等[42]研究发现Wolbachia特异性地作用于雄性果蝇染色质重构，从而影响其胚胎发育，扰乱有丝分裂纺锤体组装和染色体行为。这项研究是有关Wolbachia诱导杀雄细胞学机制的开端，为进一步研究该现象的分子机制奠定基础。Wolbachia引起的杀雄作用与多种杀雄因素有关，其中与宿主性别决定系统有着密切关系，但具体分子机制尚不清楚。

3.3 Wolbachia对果蝇其他方面的影响

Zug & Hammerstein评述了Wolbachia对宿主另外一些方面的影响，包括增加寿命、病原体抑制及营养供应等[43]。Poinsot和Merçot利用抗生素清除果蝇中的Wolbachia后发现雌性果蝇个体的生殖力下降，3代后其生殖力与共生Wolbachia的果蝇个体相同[44]。Hamm等[45]发现感染Wolbachia的雌性D.suzukii生殖力下降，但产生的后代数量与没有感染的雌果蝇无显著差异。Mazzetto等[46]研究发现Wolbachia和D.suzukii两者间的互利共生关系导致感染Wolbachia的雌性D.suzukii生殖力增加，这与Hamm的研究结果不一致，进一步分析两者的共生互作，有助于研究防控D.suzukii的策略。

并非所有Wolbachia品系都会对宿主产生生殖调控作用。Charlat等[47]对非洲加蓬地区D.yakuba种群研究发现，与该种群共生的Wolbachia对雌性果蝇个体生殖力没有明显影响，其作用为中性或接近中性。通过研究感染Wolbachia的雌性D.melanogaster揭示了Wolbachia不同基因型可能会调控宿主的生殖力，进一步推测Wolbachia的基因型是D.melanogaster种群中细菌特异性扩散的因素之一[48]。Wolbachia对雌性果蝇生殖力的影响可能与感染Wolbachia的种类、密度及宿主活动等生物因素有关，也可能受到环境温度、湿度等非生物因素的影响。这为研究果蝇种群遗传学、基因组学乃至利用果蝇中Wolbachia进行有害生物防控提供新的思路。

Wolbachia对果蝇寿命的影响表现为延长或缩短。Chrostek & Teixeira认为Wolbachia的wMelPop株系大量扩增使D.melanogaster寿命缩短是一种有害的作用[49]。齐琳等[50]研究也表明感染Wolbachia的D.melanogaster生殖力减退，幼虫发育历期延长、死亡率增加、成虫寿命缩短。但迄今为止，Wolbachia影响果蝇寿命的主要分子机制仍不清楚[6]。

Wolbachia除对宿主果蝇进行生殖调控外，还提供保护。在不同宿主遗传背景下，Wolbachia菌株wSuz在D.suzukii受到果蝇C病毒和兽棚病毒侵害时，能保护D.suzukii并抵抗两种RNA病毒，但这种抗病毒保护在宿主谱系间是极其易变的，也进一步解释了wSuz能长期存于自然种群的原因[51]。wMelCS菌株和wMelPop菌株在果蝇受到蟋蟀麻痹病毒和果蝇C病毒等侵袭时，能延缓宿主死亡[52]。另外，Osborne等[53]研究表明Wolbachia能够增加果蝇的免疫力。Shokal等[54]研究表明D.melanogaster的免疫应答受到体内共存的Wolbachia和Spiroplasma的影响，进而抵抗昆虫致病菌和非致病菌。

Wolbachia与果蝇的营养代谢也存在一定的关系。当D.simulans面临铁营养胁迫时，Wolbachia能帮助其提高产卵力，表明Wolbachia在某些特定环境下很可能参与宿主的铁营养代谢[55]。此外，Peng & Wang以D.simulans为研究对象，采用嗅觉陷阱并结合T—迷宫法测定了Wolbachia感染对果蝇嗅觉反应的影响，并采用定量PCR法，研究果蝇嗅觉反应能力与其体内Wolbachia的密度和4个嗅觉相关基因表达的关系，证实Wolbachia感染能显著提高D.simulans的嗅觉反应能力，果蝇体内Wolbachia的密度越高，嗅觉反应能力越强，且Wolbachia可能通过调节宿主相关基因的表达，从而提高宿主嗅觉反应能力[7]。随着研究的不断深入，Wolbachia与果蝇间的相互关系将不断地被挖掘和发展，现有现象将从遗传学、基因组学、医学等领域在分子水平得到不同角度的解释。

4 小结与展望

已描述的果蝇物种已达4000多种，但Wolbachia与果蝇相互作用的研究主要集中于D.melanogaster、D.simulans、D.suzukii等少数物种，且相关的分子机制尚不清楚。随着新一代测序技术的发展，Wolbachia影响果蝇生殖力、寿命、免疫力、嗅觉反应的分子机制将会得到更深入更全面的揭示。Wolbachia与果蝇之间的关系除受遗传背景、Wolbachia株系或基因型、共生菌密度、雄虫年龄、极端高温以及抗生素等影响外，其功能关系还受蛋白质及碳水化合物中碳(C)磷(P)等大量元素的影响[56]，因此研究Wolbachia与果蝇间的相互关系，应考虑更多影响因素。此外，Wolbachia可能作为一个多变的准种存在于一个单一的宿主中，能短时间内快速适应新宿主环境，诱使宿主表型、基因型改变[57]。对此深入研究有助于理解Wolbachia的基本进化过程，并促进对Wolbachia如何调控果蝇的生殖活动、能否加速果蝇物种的分化和形成、Wolbachia与果蝇间的寄生关系是如何建立并维持等科学问题的研究，进一步推动Wolbachia与其他宿主相互进化的研究。

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