交叉引物扩增-试纸条法：一种快速现地检测非洲猪瘟病毒的新技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染猪而引起的一种高度传染性、致死性疾病。世界动物卫生组织(OIE)将其列入必须报告的动物疫病。该病自1921年首次在肯尼亚被发现以来，已扩散至全球数十个国家。2018年8月我国沈阳爆发首例非洲猪瘟疫情，截止11月8日，我国已有17个省份发生62起ASF疫情，对我国的养猪业造成了重创。然而，迄今为止，尚无商品化非洲猪瘟疫苗可用，仅能依靠严格的扑杀措施防控该病。因此快速、可靠、灵敏的检测技术对于疫情的控制至关重要。目前，ASF诊断技术的金标准是病毒分离，其他检测方法包括荧光抗体试验(FAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和荧光定量 PCR等。但这些诊断方法有的耗时较长，有的需要特殊仪器，均难以在现地进行。因此，建立一种快速、简便、并能在现地进行检测的诊断方法，对于防控该病具有重大现实意义。

针对这一重大需求，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病团队建立了一种交叉引物扩增-诊断试纸联用方法(Cross-priming amplification combined with immunochromatographic strip，CPA-strip)，该技术可用于ASFV的现地快速检测。该研究基于目前ASFV毒株基因组的高度保守区域设计引物及探针，两个探针分别标记生物素和FITC。CPA扩增产物的两末端同样标记有生物素和FITC，在试纸条检测线处形成胶体金-抗生物素抗体-扩增产物-抗FITC抗体偶联复合物，胶体金固定在检测线处，检测线显色指示阳性结果。应用该方法对猪瘟病毒等常见猪病原进行检测均无交叉反应；敏感性试验结果显示，该方法最低检测限为200拷贝；组内和组间重复性试验结果显示，在相同实验条件下，试纸条重复性良好，检测线处颜色无明显差异；用该方法检测非疫区100份组织和57份血液样品，检测结果全为阴性。此外，对45份非洲疫区临床全血DNA样品检测结果显示，该方法与荧光定量PCR的符合率为97.8%(44/45)。

该研究建立的CPA-strip方法，通过交叉引物恒温扩增结合诊断试纸检测扩增产物，无需特殊仪器，可在现地进行检测，具有快速、简便、灵敏的特点，符合目前现地对ASFV检测的需求，具有巨大应用前景。此外，常规的诊断试纸主要用于抗原或抗体的检测，但在该研究中，诊断试纸检测物为末端修饰的PCR产物，检测靶标为DNA分子，具有较强的新颖性和创造性。当然，该方法为单通道检测，如果需要同时对数百个或上千个样本同时检测，则难以实现。鉴于此，多通道大规模样品的快速检测将成为该技术的未来发展方向。

评述论文来源：Gao Yao,Meng Xing-Yu,Zhang Hua-wei,et al.Cross-priming amplification combined with immunochromatographic strip for rapid on-site detection of African swine fever virus[J].Sensor Actuat B-Chem,2018,274:304-309.DOI:https://doi.org/10.1016/j.snb.2018.07.164.