进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌的分离鉴定及调查

2019-01-22李如松王建峰倪健波黄素文赵秀玲陈先锋黄绍棠

中国预防兽医学报 2018年11期

李如松，王建峰*，倪健波，黄素文，郑剑，赵秀玲，陈先锋，黄绍棠

(1.宁波检验检疫科学技术研究院，浙江宁波 315100；2.湖北检验检疫科学技术研究院，湖北武汉430050)

幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)是一种革兰氏阳性类芽孢杆菌，具有极强的生命力，可在蜂蜜[1]、蜂王浆、蜂胶和蜂花粉中存活，可引起美洲幼虫腐臭病(American foulbrood，AFB)。AFB是一种主要侵害蜜蜂幼虫和蜂蛹的急性毁灭性传染病，一旦发生极易造成蜂群衰弱及死亡，很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失[2]。在曾经暴发过该病的养蜂区域能存活长达35年，因此该病被OIE列入OIE疫病名录(OIE-listed iseases)，为必须通报的动物疫病[3]。通过对国内外蜂蜜的标准进行综合分析，发现目前蜂蜜标准主要关注质量、安全、真实性等相关的指标，而忽略了蜂蜜可以传播美洲幼虫腐臭病的风险[4]，因此本研究对进口蜂蜜进行调查，并对分离株的16S rRNA基因进行生物信息学分析，为进口蜂蜜风险控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品及主要试剂2017年度宁波地区进口蜂蜜样品71份，分别来自加拿大、澳大利亚、西班牙等10个国家和地区。MYPGP培养基(Mueller-Hinton broth、酵母抽提物、K2HPO4、丙酮酸盐、葡萄糖)由本实验室配置并添加吡哌酸和萘啶酮酸；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 细菌的分离培养及鉴定按照OIE《陆生动物诊断实验和疫苗手册》2017版2.02.02的方法进行分离，蜂蜜样品加热至45℃～50℃，PBS或生理盐水稀释，80℃处理10 min。离心弃上清液，留下约 3 mL液体，混匀后，取悬液 200 μL涂布于MYPGP平板，37℃培养7 d～8 d，挑选可疑菌落进行纯化、观察菌落形态、镜检和生化鉴定，生化鉴定参照国家行业标准SN/T 1681-2011[5]。

1.3 16S rRNA基因扩增和序列分析按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书，提取细菌DNA作为模板，参照文献[6]报道合成引物，并进行PCR扩增其16S rRNA，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后由上海派森诺生物科技有限公司测序，利用Blast和DNAStar对测序结果进行分析，并构建系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 细菌的分离鉴定对采集的蜂蜜样品进行分离培养，在71份蜂蜜样品中共分离到菌株31株，详见表 1，阳性率达到 43.6%(31/71)。分离菌在MYPGP平板上观察到整齐、粗糙、扁平或突起的灰白色小菌落(图1A)，镜检结果为革兰氏阳性杆菌(图1B)。生化反应结果与国家行业标准[5]结果一致(表1)。表明分离得到的细菌为幼虫芽孢杆菌。

图1 分离株培养性状观察Fig.1 The characters of the isolates

2.2 16S rRNA基因鉴定和序列分析细菌16S rRNA基因序列具有相对稳定和易变异的双重特点，常用于细菌的分类鉴定，Dirk Gevers等的研究结果表明菌株之间16S rRNA的序列同源性≥97%的才有可能是同种细菌[7]。31株分离细菌的PCR产物约为1 400 bp(图略)，经测序及比对分析结果显示所有菌株的16S rRNA基因序列与P.larvae(ATCC9545)等标准菌株同源性大于97%，可以判定这些菌株均为幼虫芽孢杆菌。

16S rRNA序列变化是微生物的系统发育和进化的重要的指示之一，本研究利用DNAStar软件中MegAlign对包括 31株分离株(分别来自于澳大利亚、法国，韩国、加拿大、罗马尼亚、台湾、西班牙、希腊、新西兰、匈牙利)、3株ATCC保藏菌株(ATCC13537、ATCC25368、ATCC9545)，1 株 DSM保藏菌株(DSM3615)进行核苷酸比对和同源性分析。结果显示31株分离菌的16S rRNA核苷酸序列同源性为99.8%～100%，具有较高的保守性和稳定性，遗传变异较低。基于该基因的系统发育树结果显示，35株分离菌分成2个大分支，ATCC9545单独一支，其原因可能是GenBank中ATCC9545的16S rRNA中存在多个兼并碱基原因。加拿大分离株(4株)、韩国分离株(1株)、台湾分离株(1株)、澳大利亚分离株(1株)在同一分支；法国分离株(1株)和新西兰分离株(1株)在同一分支(图2)，由此表明幼虫芽孢杆菌的16S rRNA比较保守，聚类分析发现基因差异较小，不适宜用作区分不同地理来源分离株的分子遗传标记。