迷迭香酸衍生物RAD-9通过PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路诱导胃癌MGC-803细胞凋亡

韦立群，李 清，甘嘉亮，李婉婷，潘晓杭，蒋伟哲，唐双意

(广西医科大学 1. 药学院、2. 第一附属医院药学部、3. 第一附属医院结直肠肛门外科，广西 南宁 530021)

胃癌是最为常见的癌症死亡原因之一，2017年美国估计新增胃癌病例约28 000例，新死亡病例约有10 960例[1]。胃癌发病率和死亡率极高，对公众的健康有重大影响，预计胃癌相关的死亡率将持续增加[2]。化疗是一种全身性治疗手段，对恶性肿瘤的原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用，但是化疗药物的选择性差，在产生治疗效果的同时，常出现不同程度的毒副作用[3]。因此，寻找具有低毒、高效的抗肿瘤药物成为广大科研人员的重要任务。面对现有化疗药物的特异性不足、疗效不强、毒副作用较大的缺点，中药给恶性肿瘤的临床治疗带来新的希望。利用现代生化方法深入研究中药的抗肿瘤作用机制，对发现新的抗肿瘤药物是很有意义的。迷迭香酸是一种天然来源的多酚羟基化合物，是迷迭香、紫苏、夏枯草、滇丹参等中药的有效成分，广泛应用于食品、医药品等领域，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[4]。郭峰等[5]报道，迷迭香酸能拮抗H2O2诱导血管平滑肌细胞凋亡。还有研究报道，迷迭香酸可体外抑制人胃癌细胞MKN45的Warburg效应和生长[6]。为了优化迷迭香酸的抗肿瘤活性，本课题组前期合成了几种迷迭香酸衍生物，通过初筛发现迷迭香酸衍生物RAD-9具有明显的抗肿瘤活性，本研究进一步从细胞水平初步探讨其诱导MGC-803细胞凋亡可能机制，为后续开发利用奠定坚实的理论基础。

1 材料

1.1细胞与试剂人胃癌MGC-803细胞由广西医科大学第一附属医院胃肠外科肖强课题组赠予；RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT) 购于中国索莱宝生物科技有限公司；荧光染料Hoechst 33258购于中国万类生物科技有限公司；Akt、p-Akt、p38、p-p38、GAPDH、Bax、Bcl-2、caspase-3兔抗人单克隆抗体，购自美国 Cell Signaling Technology 公司；0.25%胰蛋白酶、RIPA裂解液(强)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒，均购自中国碧云天生物技术有限公司。

1.2仪器Series 8000 WJ 型 CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific 公司)，DMILLED DFC425C型倒置荧光显微镜(德国Leica公司)，VersaMAXTM型多功能酶标仪 (美国 Molecular Dvices 公司)，电泳仪及半干转印槽(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1细胞培养及药品储存液的配制人胃癌细胞MGC-803用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2饱和湿度下常规培养，每2～3 d传代1次。迷迭香酸衍生物RAD-9(纯度大于90%)由本课题组合成，RAD-9溶于DMSO配制成100 mmol·L-1储存液，避光-20℃保存，实验时用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释成相应浓度(DMSO终体积分数不超过0.1%)。

2.2MTT法检测细胞增殖将对数生长期的MGC-803细胞，以4 000个/孔接种于96孔板中，培养12 h待细胞贴壁后，弃去孔内培养基，加入用培养基配制好的终浓度为0、12.5、25、50、100、150 μmol·L-1的RAD-9药液，每孔200 μL，每个浓度设5个复孔，培养24、48、72 h。终止培养后，每孔加入20 μL 5 g·L-1的MTT，于培养箱中避光孵育4 h，弃掉孔里的液体，加入100 μL DMSO，于震荡器上避光震荡10 min使结晶充分溶解，在492 nm处用酶标仪测定各孔的吸光值(A值)。细胞存活抑制率=(正常对照组A492 nm-给药组A492 nm)/正常对照组A492 nm×100%。

2.3流式细胞术检测细胞的凋亡率将对数生长期的MGC-803细胞接种于6孔板中，待细胞长至80%汇合时，弃去培养基，加入含有不同浓度RAD-9(0、12.5、25、50 μmol·L-1)的培养基，置于37℃、5% CO2培养箱继续培养36 h，收集细胞上清液，用冰PBS洗3遍(收集PBS洗液)，用不含EDTA的胰蛋白酶将细胞消化下来，收集所有细胞，用冰PBS洗3遍，弃掉PBS，加入100 μL Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μL PI和5 μL Annexin V，避光室温孵育15 min，再加入400 μL Binding Buffer，于1 h内上机检测。

2.4Hoechst33258染色法观察细胞核的凋亡形态将对数期的MGC-803细胞接种到内嵌有经过无菌处理的盖玻片的6孔板中，待细胞长至80%汇合时，吸出孔内培养基，加入用培养基配好的含有不同浓度RAD-9(0、12.5、25、50 μmol·L-1)的药液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养36 h，吸出孔内液体，用PBS轻轻漂洗3遍，加入4%多聚甲醛固定20 min，吸出4%多聚甲醛后，用PBS轻轻漂洗3遍，再用Hoechst 33258工作液室温避光染色20 min，吸出工作液，用 PBS轻轻漂洗3遍，再用抗荧光淬灭封片液(甘油 ∶PBS=1 ∶9)封片，于荧光显微镜下观察拍照。

2.5Westernblot检测相关蛋白表达将对数期的MGC-803细胞接种于25 cm2的培养瓶中，待细胞长至80%汇合时，吸出培养基，加入用培养基配好的含有不同浓度RAD-9(0、12.5、25、50 μmol·L-1)的药液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养36 h，吸出并收集瓶内液体，用PBS轻轻漂洗3遍，再加入细胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r·min-1离心30 min，用BCA法检测蛋白浓度。加入适量上样蛋白缓存液，于沸水浴中高温变性8 min，取50 μg的蛋白，经10% SDS-PAGE电泳分离后，使蛋白转移至 PVDF膜上，用5% BSA室温封闭 40 min，再将PVDF膜置于配好的一抗中冰上孵育过夜，二抗室温孵育60 min，用TBST室温避光洗膜3遍，最后利用双色红外荧光扫描成像系统扫膜并采集图像。每组实验重复3次。

3 结果

3.1RAD-9对胃癌MGC-803细胞增殖的影响如Tab 1所示，与空白组比较，RAD-9干预胃癌MGC-803细胞24、48、72 h后，MGC-803细胞的存活率明显受到抑制(P<0.01)。抑制效果呈时间、浓度依赖，细胞的存活率随着药物浓度的升高而降低，说明RAD-9可以有效抑制胃癌MGC-803细胞的增殖。

Tab 1 Effect of different concentrations of RAD-9on viability of MGC-803 cells (±s，n=3)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

3.2RAD-9对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响如Fig 1所示，与空白组比较，12.5、25、50 μmol·L-1的RAD-9干预胃癌MGC-803细胞36 h后，MGC-803细胞出现明显凋亡(P<0.01)，活细胞数随着药物浓度的升高而下降，晚期凋亡细胞随着药物浓度升高而增多，说明RAD-9可以促进胃癌MGC-803细胞的凋亡。

Fig 1 Effect of different concentrations of RAD-9 on apoptosis

A: Control group; B: 12.5 μmol·L-1RAD-9; C: 25 μmol·L-1RAD-9; D:50 μmol·L-1RAD-9; E: Bar graph of apoptosis rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

3.3RAD-9对胃癌MGC-803细胞核凋亡形态学的影响Fig 2的Hoechst 33258染色结果显示，与空白组比较，12.5、25、50 μmol·L-1的RAD-9干预胃癌MGC-803细胞36 h后，空白组中的细胞核形态呈圆形，淡蓝色；而经RAD-9处理后的细胞，细胞出现明显的凋亡特征，可见凋亡的细胞由于细胞核固缩，细胞核染色质凝聚、固缩呈明亮的月牙状、不规则圆形、椭圆形亮蓝白色亮光。表明 RAD-9对MGC-803细胞有一定的促凋亡作用。

Fig 2 Effect of RAD-9 on morphology of MGC-803 cells(×200)

A:Control group; B:12.5 μmol·L-1RAD-9; C: 25 μmol·L-1RAD-9; D:50 μmol·L-1RAD-9

3.4RAD-9对人胃癌MGC-803细胞凋亡相关蛋白表达的影响如Fig 3所示，与空白组相比，RAD-9作用36 h后，给药组Bcl-2蛋白表达明显下调(P<0.01)，Bax、caspase-3蛋白表达明显上调(P<0.01)，提示RAD-9对促凋亡蛋白具有明显的诱导作用。

Fig 3 Effect of RAD-9 on expression of apoptosis-relatedproteins in MGC-803 cells (±s, n=3)

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

3.5RAD-9对人胃癌MGC-803细胞Akt、p38信号通路蛋白的影响如Fig 4所示，与空白组相比，RAD-9作用36 h后，Akt、p-Akt蛋白表达下调(P<0.01)，p38 MAPK通路蛋白p38、p-p38上调(P<0.01)。提示RAD-9可能是通过抑制PI3K/Akt、激活p38 MAPK信号通路，诱导胃癌MGC-803凋亡。

Fig 4 Effect of RAD-9 on expression of Akt, p-Akt, p38, p-p38proteins in MGC-803 cells(±s, n=3)

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

4 讨论

最新统计数据显示，2015年中国有67.9万例新发胃癌患者，有49.8万人死于胃癌[7]。可见，胃癌仍然是临床上威胁国人健康最常见的消化系统恶性肿瘤之一。尽管有外科手术和化疗等有效的治疗手段，但我国胃癌总体预后仍不太乐观[8]。中药在胃癌等肿瘤治疗中具有一定优势[9]，因此，如何挖掘和开发更多疗效好、毒性低的抗肿瘤中药，对改善胃癌预后具有很重要的现实意义。

细胞凋亡是组织稳态的关键调节因子，受通路激活和抑制相互作用的调控，细胞凋亡的调控异常与神经退行性疾病、慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病等明显相关[10]，这种主动诱导细胞死亡是中药抗肿瘤治疗的重要机制之一[9]。本研究结果显示，RAD-9能明显抑制人胃癌MGC-803 细胞的增殖，并随着浓度的递增，出现更多核固缩等凋亡形态学特征的肿瘤细胞，流式细胞术定量检测结果也显示，凋亡细胞数随着药物浓度增大而增多。进一步的Western blot检测结果显示，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达明显减少，而促进凋亡的Bax蛋白水平明显提高，凋亡启动标志蛋白caspase-3表达明显增强。这些结果提示RAD-9具有明显的凋亡诱导作用。

PI3K/Akt信号通路是细胞的重要调节通路，参与调节细胞生长、代谢、凋亡、转移、化疗耐药等，在大多数人类肿瘤中存在表达失调，越来越多的研究表明，PI3K/Akt与许多类型癌症(包括胃癌)的发生发展密切相关[11]。PI3K/Akt可以调控凋亡相关蛋白Bcl-2家族成员，Akt的激活能使Bcl-2从聚合体中释放出来，从而发挥抗凋亡作用[12]，因此，抑制PI3K/Akt通路可以抑制肿瘤的生长或发展。在本研究中，迷迭香酸衍生物RAD-9可以明显抑制Akt、p-Akt蛋白表达水平，提示RAD-9可以明显抑制PI3K/Akt通路的信号传导。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)包括 JNK、p38和ERK，其中p38受紫外线、渗透压、热休克和多种细胞因子等刺激而产生相应效应，参与调节细胞的增殖、分化、迁移、侵袭和死亡等，其功能异常与肿瘤的发生、进展和患者的生存期明显相关[13]。活化的p38可诱导Bax转位，介导caspases家族蛋白的活化[14]。p38 MAPK信号转导通路主要与促进肿瘤细胞凋亡密切相关，p-p38对肿瘤的形成有负向调控作用，能抑制恶性肿瘤的形成和肿瘤细胞的增殖。p38 MAPK促进细胞凋亡的机制主要有：增强c-myc基因表达，促进p53、c-jun磷酸化，参与介导Fas/FasL凋亡途径，使Bax转位以诱导线粒体凋亡途径等，最终诱导细胞凋亡[15]。我们的研究显示，RAD-9干预MGC-803细胞后，p38、p-p38明显上调，提示RAD-9可能通过激活p38 MAPK通路，诱导细胞凋亡。

综上所述，迷迭香酸衍生物RAD-9可以抑制胃癌MGC-803细胞增殖，并能诱导其凋亡，其机制可能与抑制PI3K/Akt、激活p38 MAPK信号通路有关，本研究为开发和改造迷迭香酸衍生物提供了理论参考。

(致谢：本实验于广西医科大学医学科学实验中心完成，感谢实验室老师和同学的指导和帮助！)

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