miRNA表达与免疫细胞因子相关性在原发性肝癌早期诊断和预后中的作用①

徐晓宏 高守宝 王 玥 胡文静

(齐齐哈尔医学院附属第三医院,齐齐哈尔 161000)

原发性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma ，PHC)是一种进展迅速，预后很差的恶性肿瘤，是全球第五大常见肿瘤，占世界癌症相关死亡的第三位,每年新发病例约有70万人，其中中国患者占50%以上[1]。由于PHC早期诊断困难，大多数患者临床确诊时已达晚期，导致其5年生存率仅为10%～15%。此外，PHC治疗中的耐药性、肿瘤的复发、发展和迁移等瓶颈都亟待新的敏感特异的早期预测和早期检测，并制定更有效的治疗策略，能够改善肝癌的临床结果。肿瘤发生过程中的肝硬化、硬化结节转变为癌前病变被广泛证实及接受,绝大多数肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。因此炎症因素及免疫因素在肝癌发生发展中的作用应该得到重视。目前Micro RNA(miRNAs)与肝癌相关性的研究已经阐明了一些miRNAs的重要意义[2]。miRNAs是一类约含20～25个核苷酸的非编码RNA，它可以通过与靶基因3′端非翻译区结合从而影响基因的翻译和稳定性。一个microRNA可调节多个至数百个靶基因，几种microRNA也可以联合调控单一基因的表达，microRNA和靶基因间形成了复杂的调节网络，参与细胞生长、分化、炎症和癌变等多种生理和病理过程。目前已有大量的证据证明miRNA在PHC的发生发展中起到了十分重要的作用，包括肝细胞生长、应激反应、代谢、病毒感染与扩增、基因表达、肝表型的维持等。研究发现多种miRNAs在人类PHC细胞中异常表达[2]。这也就提示我们 miRNAs也许能够作为PHC诊断的一种新方法。同时有研究表明miRNA能抵抗RNA内源性酶的降解从而在血浆中稳定存在。miRNAs的异常表达是否与循环及组织免疫因子相关，循环 miRNAs是否可以作为理想的血源性新型生物标志物用于肿瘤的早期检测[3]，可能为原发性肝癌诊断的生物标记物和预后干预的靶点提供了新的研究方向。

1 材料与方法

1.1研究对象 本研究经齐齐哈尔医学院伦理委员会批准，所有入组人员均签署知情同意书。56例原发性肝癌患者选取2015年1月～2017年1月间我院肿瘤科手术或活检诊断病例，所有患者均经病理诊断确诊。男34例，女22例。年龄36～58岁，平均(47.26±5.67)岁。临床TNM分期：Ⅱ期8例，Ⅲa期19例，Ⅲb期21例，Ⅳ期6例，Ⅴ期2例。其中36例有乙肝病史、酒精性肝硬化及20例其他非炎性病因者。所有患者经手术或活检诊断分别切取3块直径约为0.5 cm的肿瘤组织和3块癌旁组织(距离癌灶边缘5 cm)。组织样本离体后，迅速置入液氮中保存备用。另收集40例肝硬化患者，其中20例为肝炎后肝硬化，其余20例为酒精性或其他慢性肝病肝硬化。收集40例肝炎患者，以及68例健康对照，所有入组患者均抽取空腹静脉血5 ml。血液样本收集后分离血清，血清于2 h内进行相关因子检测，血浆立即放置于-80℃保存备用。

1.2方法

1.2.1miRNA 的提取与扩增 在生物安全柜中，首先对肝癌患者肝组织、血浆以及肝硬化组、肝炎组及健康对照组血浆提总RNA,总RNA提取采用Trizol(Thermo Fisher Scientific)法提取，组织先在液氮中研磨成粉，后加入Trizol试剂，血浆直接根据体积加入Trizol试剂。通过异丙醇沉淀浓缩RNA。根据miScript Reverse Transcription Kit说明书将RNA逆转录成cDNA，-80℃保存。通过miRBase数据库查找miR- 146a、miR- 224、miR- 34c、miR- 200a、miR- 148b、miR- 375成熟序列，以GAPDH为内参基因，采用荧光定量PCR方法(Real- time PCR，RT PCR)检测miRNA表达量的变化[3]。RTPCR引物由北京华大基因设计并合成(表1)。根据QuantiTect SYBRGreen PCR Kit说明书配置PCR反应体系，反应条件如下：95℃预变性30 s；40 个PCR 循环(95℃，30 s；60℃，20 s；72℃，20 s)；以2-ΔΔCT法对miRNA表达程度进行分析(其中ΔCT为CT靶基因与CT GAPDH的差值)，2-ΔΔCT>2为表达上调，2-ΔΔCT<0.5 为表达下调[4]。

表1实时定量PCR引物序列

Tab.1PrimersequenceofReal-timequantitativePCR

miRNAsSequencesofforwardprimers(5'-3')Sequencesofreverseprimers(5'-3')GAPDHGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATGTGCAGGGTCCGAGGTmiR-34cCGCGCTAGCTTATCAGACTGAmiR-224CAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAmiR-135ACGGGGCGATATGGATTTTTmiR-200aGAGTGCATCTTACCGGACAGTmiR-148bGGCGCAAGTTCTGTTATACACmiR-375AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT

1.2.2血清肿瘤标志物检测 选取临床常用测血清肿瘤标志物甲胎蛋白(α- fetoprotein，AFP)、癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen，CEA)、CA19- 9、CA125为检测对象，采用ADVIA Centaur CP全自动化学发光免疫分析仪对所有分离的血清进行检测，检测用试剂盒及质控血清均购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，所有操作严格按照说明书指示进行。正常参考值:AFP:0～8.1 μg/L, CEA 0～5.0 μg/L, CA19- 9:0～39 U/ml，CA125:0～35 U/ml[5]。

1.2.3血清炎性因子检测 采用实时荧光定量PCR探针法对血清乙肝病毒HBV DNA进行检测，操作严格按照罗氏有限公司COBASAmpli- Prep- COBAS TaqMan(CAP- CTM)检测试剂盒进行。乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(抗- HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(抗- HBe)、乙肝核心抗体(抗- HBc)、血清中Th1类细胞因子(IL- 12、IFN- γ和TNF- α)水平及Th2类细胞因子(IL- 4、IL- 6和IL- 10)水平采用酶联免疫ELISA法检测。

2 结果

2.1miRNA在血清中及癌、癌旁组织中表达情况 分别对健康组、肝炎组、肝硬化组和PHC组血清miRNA表达的相对CT值统计分析，发现相对于健康组miR- 34c(P=0.032)、miR- 224(P=0.046)、miR- 146a(P=0.027)在PHC组表达显著上调(见图1A)，miR- 200a(P=0.034)、miR- 148b(P=0.022)、miR- 375(P=0.030)在PHC组表达显著下调，差异具有统计学意义。但肝炎组和肝硬化组与健康组和PHC组相比较，差异没有统计学意义。

miRNA在组织中表达如图1B所示，相对于癌旁组织，miR- 34c(P=0.022)、miR- 224(P=0.018)、miR- 146a(P=0.016)在PHC组表达显著上调，miR- 200a(P=0.015)、miR- 148b(P=0.024)、miR- 375(P=0.029)在PHC组表达显著下调，差异具有统计学意义。

2.2血清miRNAs与细胞因子表达相关性 在众多miRNA分子中，发现miR- 375与miR- 146a表达水平与细胞因子相关，将HBsAg 、抗- HBs、抗- HBe、抗- HBc、IL- 12、IFN- γ、TNF- α、IL- 4、IL- 6和IL- 10作为自变量，血清 miR- 375 和miR- 146a的表达水平作为因变量，纳入线性回归模型进行多因素分析，结果显示 ,HBsAg与血清miR- 375 和miR- 146a存在回归关系，miR- 375随HBsAg表达水平升高而降低，而miR- 146a随HBsAg达升高而升高。 IFN- γ与miR- 146a存在回归关系， miR- 146a随IFN- γ表达水平降低而升高(表2、3)。

2.3血清 miR- 375 和miR- 146a的表达水平对原发性肝癌的诊断意义 利用ROC曲线，评价血清miR- 375和miR- 146a在204例研究对象中检测出56例原发性肝癌的能力，结果显示，miR- 375在204例研究对象中检测出56例原发性肝癌患者的灵敏度为73.9%，特异度为93.0%，AUC为 0.838(95%CI：0.780～0.897)，miR- 146a在204例研究对象中检测出56例原发性肝癌患者的灵敏度为74.2%，特异度为92.6%，AUC为 0.838(95%CI：0.780～0.897)，而CA19- 9和AFP 在同样的人群中诊断出原发性肝癌患者灵敏度分别为63.0%和59.6%，特异性分别为84.2%和81.8%，AUC 分别为0.722(95%CI：0.584～0.802)和0.694(95%CI：0.602～0.784)，miR- 375 和miR- 146a诊断能力大于CA19- 9和AFP(图2)。

2.4miRNA与细胞因子表达相关性与原发性肝癌预后相关性 未发现6例癌症患者各miRNA分子与细胞因子表达水平与肿瘤大小、临床分期及转移、复发情况具有明显相关性，提示不能明确miRNA与细胞因子表达与预后的相关性。

图1 各mi- RNA在血清中及癌、癌旁组织中表达情况Fig.1 Relative expression levels of miRNAs in serum and tissuesNote: A.Relative expression levels of miRNAs in different groups;B.Relative expression levels of miRNAs in tumor tissues and paracancerous tissues，*.P<0.05.

表2血清miR-375与各细胞因子表达水平线性回归分析

Tab.2LinearregressionanalysisofserummiR-375andcytokinelevels

FactorsB95%CItPHBsAg0.228(-0.416,-0.144)-2.4320.021anti-HBs0.184(-0.378,0.226)-1.4420.201anti-HBe-0.189(-0.342,0.160)-1.6410.238anti-HBc0.114(-0.082,2.385)1.3220.199IL-120.098(-0.262,0.431)1.4250.186IFN-γ0.106(-0.090,0.624)0.9860.372TNF-α0.022(-0.204,0.458)1.2120.225IL-40.078(-0.196,0.384)1.4550.169IL-60.021(-0.148,0.186)0.3680.824IL-100.057(-0.120,0.428)0.9020.522

表3血清miR-146a与各细胞因子表达水平线性回归分析

Tab.3LinearregressionanalysisofserummiR-146aandcytokinelevels

FactorsB95%CItPHBsAg0.468(0.244,0.820)3.0260.015anti-HBs0.204(-0.087,0.456)1.4020.198anti-HBe0.154(-0.168,0.322)1.6620.204anti-HBc0.196(-0.204,0.455)1.4180.193IL-120.069(-0.182,0.316)1.0600.482IFN-γ-0.314(-0.727,-0.105)-2.2860.028TNF-α0.041(-0.196,0.262)1.1220.156IL-40.084(-0.102,0226)1.5450.149IL-60.049(-0.205,0.286)0.8740.628IL-100.132(-0.208,0.397)1.2160.178

图2 血清 miR- 375、miR- 146a、AFP和CA19- 9在全部研究对象中诊断PHC的ROC曲线Fig.2 ROC curves of serum miR- 375,miR- 146a,AFP and CA19- 9 to diagnose PHC in all subjects

3 讨论

原发性肝癌起病隐匿，预后不良，其发生发展过程与多种因素相关，而目前临床主要依靠血清肿瘤标志物、活检及影像学来诊断PHC，但这些诊断手段灵敏度及特异性都有其局限性，导致诊断价值欠佳。近年来，随着分子生物学诊断技术不断发展，miRNA表达异常与肿瘤相关性越来越受到关注。因此，寻找新的更加敏感和特异的PHC诊断生物标记物成为目前研究的热点及难点。研究发现，肿瘤患者不仅肿瘤组织中miRNA表达有明显变化，而且在其血清中miRNA的表达也呈现明显异常。说明血清miRNA以其方便及非侵入性的优势可用于肿瘤的早期检测，可作为理想的诊断标志物。

本研究通过循证医学手段，根据国内外文献报道，筛选到miR- 146a、miR- 224、miR- 34c、miR- 200a、miR- 148b、miR- 375六个miRNA在PHC中表达异常。通过对健康组、肝炎组、肝硬化组及PHC不同疾病发展组别的血清中和组织中的miRNA表达水平的检测，发现miR- 34c、miR- 224、miR- 146a在PHC组表达显著上调，miR- 200a、miR- 148b、miR- 375在PHC组表达显著下调。该结果与其他关于肿瘤组织中miRNA表达异常结果是相符的，如Chamani等[6]发现miR- 34家族表达沉默可使多种癌基因DNA甲基化，miR- 34c的异常升高上调多种癌基因表达。Shen等[7]研究发现，miR- 224在宫颈癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌和肝癌等恶性肿瘤的细胞组织中明显表达上调，且高表达的miR- 224与肿瘤的发展及预后相关。Lin等[8]发现miR- 146a在非小细胞癌、乳腺癌、肝癌中表达异常升高，它可通过异常升高表达抑制抑癌基因FOXO1 在肝癌中的表达从而促进肿瘤细胞的增殖和细胞周期进展。Dhayat等[9]发现miR- 200a在原发性肝癌中明显表达下调，在动物试验中通过沉默miR- 200a可促进肝癌的发生。它可调节钙黏蛋白和肿瘤β- 链蛋白(β- catenin)和肿瘤生长因子(TGF- β)等多个靶基因。Ziari等[10]比较了101例肝癌患者及40例正常对照组的miR- 148b表达水平，发现miR- 148b表达在肿瘤组织中明显下调，且与预后相关；Mirzaei等[11]发现miR- 375、miR- 206、miR- 223在肝癌患者癌组织和循环中都检测到异常表达， miR- 375可能影响p53、p21、PTEN、PI3K- AKT、c- myc和STAT3等重要的生物学途径。该六种microRNAs在PHC肝癌组织和癌旁组织中的表达差异，补充了原发性肝癌miRNA的差异表达谱，为原发性肝癌提供了诊断靶分子。但由于microRNAs参与了多种靶基因和生物学途径的调控，欲研究某一miRNAs具体功能，需通过过表达或RNA抑制等多种手段验证其可能影响的靶基因，这将有待于进一步研究。

肿瘤发生过程中肝硬化、硬化结节转变为癌前病变被广泛证实及接受,绝大多数肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。因此炎症因素及免疫因素在肝癌发生进展中的作用应该得到重视。本研究发现，HBsAg与血清miR- 375 和miR- 146a存在回归关系，miR- 375随HBsAg表达水平升高而降低，而miR- 146a随HBsAg达升高而升高。 IFN- γ与miR- 146a存在回归关系，推测乙肝病毒感染后会引起miR- 375表达的下降 和miR- 146a表达的升高。说明病毒利用宿主自身miRNA间接调控一些蛋白和免疫因子的表达，影响机体的免疫能力，达到免疫逃逸的目的，从而为自身病毒复制与生存创造良好的条件。

众所周知，肝癌的良好预后取决于早期诊断和治疗，尽管目前临床中活检病理检测是确定原发性肝癌诊断的金标准，但由于PHC发病隐匿，多数患者在确诊PHC时疾病早已迁延。通过影像学和血清肿瘤标志物等无创诊断仍是肝癌普查应用较多的手段，但是难免还是有较高的漏诊率和误诊率。本研究中，还发现血清 miR- 375 和miR- 146a诊断敏感性和特异性均优于CA19- 9和AFP，提示miR- 375 和miR- 146a可作为原发性肝癌，尤其是有乙肝病毒感染史患者原发性肝癌的诊断标志物。

总之，随着对循环miRNAs的生成机制和生物学功能与原发性肝癌的关系不断深入，通过进一步的基础实验和临床研究相结合，我们可以相信，通过循环miRNAs表达异常来诊断和治疗PHC将会有广阔的临床应用前景。

[1] Forner A,Llovet JM,Bruix J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet,2012,379 (9822):1245- 1255.

[2] 陈 彪,徐细明.miRNA在原发性肝癌中的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2012,17(10):946- 950.

Chen B，Xu XM.Progression of mi RNA in the research of primary liver cancer[J].Chin Clin Oncol，2012,17(10):946- 950.

[3] 米旭光,刘 磊,李首庆,等.早期肝细胞癌患者循环microRNA- 199a/b- 3p的检测及临床意义[J].中国免疫学杂志,2015,31(5):683- 685，689.

Mi XG，Liu L，Li SQ,etal.Value of serum microRNA- 199a/b- 3p on early diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Chin J Immunol, 2015,31(5):683- 685，689.

[4] Marco D′Anzeo,Luca Faloppi,Mario Scartozzi，etal.The role of micro- RNAs in hepatocellular carcinoma:from molecular biology to treatment[J].Molecules，2014,19：6393- 6406.

[5] 李 飞,李德新,周广朋.miR- 634在肝癌中的表达及对肝癌细胞生物学行为的影响[J].中国免疫学杂志，2016,32(8):1160- 1164.

Li F, Li DX,Zhou GP.Expression of miR- 634 in hepatocellular carcinoma and its effect on biological behavior of Hepatocellular carcinoma cells[J].Chin J Immunol,2016,32(8):1160- 1164.

[6] Chamani F,Sadeghizadeh M,Masoumi M，etal.Evaluation of MiR- 34 family and DNA methyltransferases 1,3A,3B gene expression levels in hepatocellular carcinoma following treatment with dendrosomal nanocurcumin.[J].Asian Pac J Cancer Prev,2016,17(S3):219- 224.

[7] Shen SN,Wang LF,Jia YF,etal.Upregulation of microRNA- 224 is associated with aggressive progression and poor prognosis in human cervical cancer[J].Diagn Pathol,2013,8:69.

[8] Lin CW，Chang YL，Chang YC，etal.microRNA- 135b promotes lung cancer metastasis by regulating multiple targets in the Hippo pathway and LZTS1[J]. Nat Commun，2013，4:1877.

[9] Dhayat SA,Mardin WA,Köhler G,etal.The microRNA- 200 family- - a potential diagnostic marker in hepatocellular carcinoma? [J].J Surg Oncol,2014,110(4):430- 438.

[10] Ziari K,Zarea M,Gity M,etal.Downregulation of miR- 148b as biomarker for early detection of hepatocellular carcinoma and may serve as a prognostic marker[J].Tumour Biol,2016,37(5):5765- 5768.

[11] Mirzaei HR,Sahebkar A,Mohammadi M,etal.Circulating microRNAs in hepatocellular carcinoma:potential diagnostic and prognostic biomarkers[J].Curr Pharm Des，2016,22(34):5257- 5269.