羟氯喹通过PI3K/Akt通路对系统性红斑狼疮外周血单个核细胞凋亡的作用研究①

代玉芳 向诗非 何三山 盛娇娥 张巍琼 赵小丹 武清超 向 阳 苏林冲

(湖北民族学院附属民大医院风湿科风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，恩施 445000)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是慢性自身免疫性疾病，病情进展迅速，多脏器受累，生活质量差，病死率高，严重危害患者健康[1]。目前还没有治愈方法，多为激素联用免疫抑制剂。羟氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)目前是临床治疗SLE的一线用药，应用广泛，作用于免疫系统能够抑制巨噬细胞抗原呈递，抑制淋巴细胞增殖、免疫复合物的形成、炎性因子分泌、机体的免疫应答，对SLE临床疗效较好，但其具体治疗机制仍不确切[2]。

研究报道显示，SLE患者存在自身淋巴细胞失衡，T淋巴细胞过度活化，引起多克隆B细胞激活分化增加，且机体对过多的免疫细胞清除能力下降，机体免疫系统失去平衡，大量自身抗体产生，多器官受累，引起一系列临床症状[3，4]。研究发现，系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞凋亡率增高，并且与患者疾病的活动程度呈现为正相关关系[5,6]。因此，在此项研究中，我们以SLE患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)为研究对象，观察HCQ对SLE患者PBMCs凋亡的作用，并研究其相关机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象 选取2014年1月至2016年12月我院诊断SLE患者共30例，平均年龄(32±8)岁，女性26例，男性4例。所有患者符合ACR1997的SLE分类标准，所有患者均处于活动期，均为初发SLE，未使用免疫抑制剂治疗。另外选取我院体检中心健康患者15例，女性13例，男性2例，近期未出现感染及无免疫相关病史。本研究经我院伦理委员会批准，并签署知情同意书。

1.1.2主要试剂和仪器 硫酸羟氯喹片购自赛诺菲公司；MTT、LY294002购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基、胎牛血清、胰酶购于美国Gibco公司；Annexin V- FITC/PI双染流式细胞检测试剂盒购于美国Invitrogen公司；Gallios流式细胞仪(美国 Beckman公司);SDS- 聚丙烯酰胺、PBST溶液、垂直电泳仪及GIS- 2020D凝胶图像分析系统购于Sigma公司；bcl- 2、bax、PI3K、pAKt及mTOR抗体购于美国Abcam公司；二抗购自中杉金桥公司。

1.2方法

1.2.1PBMCs的分离培养 晨起空腹采SLE患者和对照组的静脉血10 ml，肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，收集中间层细胞，分离PBMCs，5倍体积生理盐水洗涤， 2 000 r/min离心10 min×2次。获取PBMCs后加入细胞培养瓶，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养，细胞浓度为1×106ml-1。

1.2.2MTT法检测HCQ对SLE患者PBMCs细胞生长抑制的影响 取SLE患者PBMCs细胞100 μl/孔接种于96孔板，培养过夜后加入不同浓度的羟氯喹进行处理。SLE组PBMCs细胞中HCQ终浓度分别为0、5、25 mg/L，作用于细胞24、48、72 h，另设置正常对照组，加入5 mg/ml MTT每孔20 μl，4 h后弃上清，加入150 μl的DMSO，振荡后570 nm测吸光度值。每组6个复孔，实验重复3次。

1.2.3Annexin V- FITC/PI流式细胞仪检测HCQ对SLE患者PBMCs细胞凋亡率的影响 PBMCs细胞接种于6孔板，SLE组加入HCQ，终浓度为0 mmol/L及25 mg/L，另取正常对照组，放入培养箱培养48 h后收集细胞，按1×106ml-1密度加入结合缓冲液重悬，按照Annexin V- FITC/PI双染试剂盒说明进行操作，加入5 μl Annexin V- FITC，避光10 min后离心，弃上清再次加入缓冲液重悬，加入10 μl PI染色液，混匀后4℃避光染色15 min，30 min内进行上机检测。每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.4Western blot方法检测HCQ对SLE患者PBMCs细胞BAX、BCL- 2、PI3K、pAKt及mTOR等相关蛋白的表达影响 PBMCs细胞接种于细胞培养瓶，SLE组加入HCQ，终浓度为0 mmol/L及25 mg/L，另取正常对照组，放入培养箱培养48 h后收集细胞，取相同量的样品,进行12%凝胶电泳(SDS- PAGE)，转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉过夜，封闭阻断抗体，一抗稀释溶液为0.5%BSA溶液，和印迹膜在室温下孵育2 h，取出用TBST洗膜10 min重复3次，二抗稀释溶液为0.5%BSA溶液，印迹膜在室温下孵育2 h后洗涤液TBST 15 min重复3次，加入ECL试剂，凝胶成像仪观测和统计分析。

1.2.5PI3K/AKT通路抑制剂 LY294002对PBMCs生长抑制和凋亡率的影响 为观察PI3K/AKT通路抑制剂对HCQ作用的影响，采用SLE组、HCQ 25 mg/L，HCQ 25 mg/L+LY294002 20 μmol/L，加入药物作用细胞48 h，再次进行MTT实验及Annexin V- FITC/PI流式细胞仪实验，检测PBMCs生长抑制和凋亡率。实验方法同前。

2 结果

2.1HCQ对体外SLE患者PBMCs细胞生长抑制作用 采用MTT实验检测各组PBMCs细胞生长抑制的作用，SLE组比正常对照组生长抑制率升高，存活率下降(P<0.05)；与SLE组相比，HCQ 5和25 mg/L组的生长抑制率显著增加，存活率明显降低，具有浓度和时间依赖性趋势，见表1、图1(P<0.05)。

2.2HCQ对SLE患者的PBMCs细胞凋亡率的影响 如图2所示,右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。在正常对照组外周血单个核细胞凋亡率为(2.7±0.4)%，SLE组患者PBMCs细胞凋亡率为(6.2±1.7)%，HCQ 5 mg/L时凋亡率为(18.2±1.8)%，HCQ 25 mg/L时凋亡率(23.5±2.1)%，SLE组、HCQ组与正常对照组相比PBMCs细胞凋亡率均有显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；HCQ组与SLE组相比PBMCs细胞凋亡率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；HCQ 25 mg/L 时凋亡率显著高于5 mg/L组，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见图2、3。

2.3HCQ对SLE患者PBMCs的 PI3K、pAKt、mTOR、BCL- 2、BAX、caspase- 3蛋白表达的影响 HCQ组、SLE组与正常对照组比较，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，bax和caspase- 3的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。HCQ组与SLE组比较，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，bax和caspase- 3的表达明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，且具有浓度依赖性，见图4。

表1各组PBMCs细胞生长抑制率的比较

Tab.1ComparisonofgrowthinhibitionratesofPBMCscellsineachgroup

Groups24h48h72hControl000SLE10.4±1.721)11.3±1.591)12.7±2.291)HCQ5mg/L17.7±3.142)23.6±2.982)28.1±3.382)HCQ25mg/L27.6±3.852)34.9±4.242)40.3±4.762)

Note：Compared with the normal control,1)P<0.01；compared with SLE group,2)P<0.01.

图1 各组PBMCs细胞存活率的比较Fig.1 Comparison of cell survival rate of each group

2.4PI3K/AKT通路抑制剂 LY294002对HCQ导致PBMCs凋亡作用的影响 由图5、6可知，HCQ组与SLE组相比，PBMCs细胞存活率下降，凋亡率升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；同时加入HCQ 25 mg/L及PI3K/AKT通路抑制剂 LY294002 20 μmol/L 对SLE患者PBMCs细胞作用48 h后，PBMCs细胞凋亡率及存活率与SLE组相比差异无统计学意义(P>0.05)，说明PI3K/AKT通路抑制剂 LY294002对HCQ导致的SLE患者PBMCs细胞凋亡具有阻断作用。

图2 各组PBMCs细胞凋亡率的比较Fig.2 Comparison of apoptotic rate of PBMCs cells in each group detected by flow cytometry with Annexin V/PI double stainingNote: A.Control group；B.SLE group;C.HCQ 5 mg/L group;D.HCQ 25 mg/L group.

图3 羟氯喹对SLE患者的PBMCs细胞凋亡率的影响Fig.3 Effects of HCQ on apoptotic rate in PBMCs of SLENote: Compared with HCQ group and SLE group,##.P<0.01;compared with the normal control,**.P<0.01.

图4 羟氯喹对SLE患者的PBMCs细胞蛋白表达的影响Fig.4 Effects of HCQ on PI3K,pAKt,mTOR,Bcl- 2 protein expressions in PBMCs of SLE

图5 MTT测LY294002及羟氯喹对SLE患者PBMCs细胞存活率的影响Fig.5 Effects of HCQ alone and HCQ combined with LY294002 on survival rate of PBMCs in SLE patiets detected by MTTNote: Compared with SLE group,**.P<0.01.

图6 流式细胞仪测单用羟氯喹和羟氯喹联用LY294002对SLE患者PBMCs细胞凋亡率的影响Fig.6 Effects of HCQ and HCQ combined with LY294002 on apoptotic rate of PBMCs in SLE detected by methods of flow cytometryNote: Compared with SLE group,**.P<0.01.

3 讨论

SLE是一种弥漫性结缔组织病，以免疫性炎症为特异表现，累及多脏器多器官，病程迁延，预后较差，发病机制仍不明确，可能是在各种环境、性激素、药物、感染或其他因素的作用下，引发机体异常免疫反应，产生大量抗体及免疫复合物，引起机体组织受损[7,8]。研究发现，SLE出现T淋巴细胞免疫应答异常，导致B淋巴细胞介导的体液免疫出现过度活化，免疫系统失去平衡，产生大量抗原抗体复合物，引起多脏器受累[9,10]。多项研究报道，SLE患者体内免疫细胞凋亡调控异常，淋巴细胞凋亡率升高，尤其以T淋巴细胞更为显著，并且与SLE的活动程度正相关[11- 15]；本研究发现，SLE患者PBMC细胞凋亡率较正常对照组明显升高(P<0.05)，与其他报道结果一致。

HCQ目前是自身免疫性疾病的一线用药，广泛用于SLE的治疗，临床效果较好[16]。HCQ可以在细胞溶酶体内涵体高浓度积累，使酸性囊泡的pH值增加，抑制酸性蛋白酶的功能，抑制内吞作用，阻止抗原抗体复合物的形成和转运；抑制NK细胞活性，抑制外周血单个核细胞的活性和功能，阻断抗原呈递，减少细胞因子产生；降低免疫反应[17,18]。本研究显示，HCQ可以诱导SLE患者外周血单个核细胞的凋亡，且凋亡率随着HCQ的浓度增加而增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

PI3K/Akt信号通路参与多种生理过程，在细胞生长、发育、分化和凋亡中起重要作用。活化的P13K激活Akt，信号进一步转导，Akt激酶能调控下游的mTOR、caspase、BAX/Bcl- 2等多条信号通路的活性，引起级联反应，参与细胞的生理代谢过程[19]。BAX和BCL- 2是常见的促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白[12]， caspase- 3是细胞凋亡级联的关键酶,是细胞凋亡级联的核心，caspase- 3酶的水解活性超细蛋白作用可直接诱导细胞凋亡，并能损伤DNA加速凋亡[3,20]。本研究显示，HCQ组、SLE组与正常对照组比较，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表达明显下降(P<0.05)，bax和caspase- 3的表达明显增加(P<0.05)。HCQ组与SLE组比较，PI3K、pAKt、mTOR、bcl- 2的表达明显下降(P<0.05)，bax和caspase- 3的表达明显上升(P<0.05)，提示HCQ能够通过PI3K/Akt信号通路促进SLE患者PBMCs细胞的凋亡。同时加入HCQ和PI3K/AKT通路抑制剂 LY294002，发现PBMCs细胞凋亡率及存活率与SLE组相比差异无统计学意义，说明LY294002能够阻断HCQ对SLE患者PBMCs的凋亡作用。这提示HCQ是通过PI3K/Akt信号通路促进SLE患者PBMCs的凋亡。

综上所述，HCQ能够通过PI3K/Akt信号通路促进SLE患者体外PBMCs的凋亡。

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