表皮干细胞的特点及应用于皮肤软组织创面修复的实验研究进展*

尹诗璐 综述 秦泽莲 审校

(北京大学第三医院成形外科，北京 100191)

意外伤害造成的复杂大面积创面以及各种疾病导致的慢性难愈性创面往往难以修复。自体皮片或皮瓣移植是目前整形外科常用的修复方法，然而供皮区所形成的新的创面往往带来一定的功能及形态损伤。随着微创外科理念的广泛深入，如何通过最小的创伤达到最佳修复效果成为各外科专业的研究重点及难点。表皮干细胞研究为大面积皮肤创面的微创修复提供了新的启示。提取自皮肤组织的特异性干细胞，具有自我增殖及分化形成多种皮肤细胞成分的能力，在皮肤软组织创面愈合及再生中发挥重要作用[1,2]。本文对表皮干细胞的特点及其在皮肤软组织创面修复中的实验研究进展进行综述。

1 表皮干细胞的特点

1.1 表皮干细胞的形态及分布

表皮干细胞来源于外胚层，形态呈鹅卵石形，胞体透亮且排列紧密，主要分布于皮肤基底层及毛囊隆突部位，并且随个体年龄和部位不同而有所差异。作为慢周期细胞，表皮干细胞的增殖分化受到壁龛(niche)及细胞内信号通路的影响。壁龛是表皮干细胞赖以生存的外部微环境，主要有三种，分别位于表皮细胞基底层、毛囊隆突部位及皮脂腺基底部[3]。不同的壁龛对表皮干细胞的生理状态、信号传导及分化方向产生不同的影响[1,4,5]。2012年，Dahl[6]的研究显示，表皮基底层、皮脂腺和毛囊隆突区域分布有丰富的表皮干细胞，这些细胞可分化成不同的皮肤细胞，替换死亡的表皮、皮脂腺和毛囊细胞，从而维持皮肤的自我更新及稳态。

1.2 表皮干细胞的筛选及鉴定

在过去的10余年中，表皮干细胞的筛选及鉴定方法得到不断改善。Ⅳ型胶原快速黏附法是目前常用的筛选表皮干细胞的简单方法，表皮干细胞表面高表达β1整合素，而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达β1整合素，利用这一特性将细胞置于预铺Ⅳ型胶原的培养皿中，表皮干细胞依靠其β1整合素能较为快速地与Ⅳ型胶原进行黏附而与其他细胞成分区分开[7,8]。流式细胞分选法则利用表皮干细胞高表达α6整合素而不表达CD71的特性，通过设立特定的门控通道而高效分选出α6整合素+CD71-的表皮干细胞[9]。此外，通过免疫荧光、免疫组化、基因表达检测等方式，检测整合素α6、P63、K19等的表达也是较为常用的表皮干细胞筛选鉴定方式[7]。除了以上常见的表面标志物，也有文献报道应用delta样蛋白1(delta-like protein 1，DLL1)、富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains protein 1，LRIG1)、CD46作为标志物进行表皮干细胞的筛选[2,7,10]。

1.3 表皮干细胞的分化及增殖特点

表皮干细胞不断通过自我分裂及分化维持皮肤的稳态。2001年，Dunnwald等[11]应用Hoechest和碘化丙啶荧光染色方法，通过设定特定的门控，证实鼠表皮基底细胞存在干细胞[(3.4±0.2)%]、短暂扩增细胞[(89.2±1.1)%]和非增殖细胞[(7.4±0.9)%]3种不同分化状态。在受到特定刺激信号后，表皮干细胞不均等分裂形成新的表皮干细胞及若干短暂扩充细胞，短暂扩充细胞再通过有限的细胞分裂形成终末细胞。由于这3种细胞增殖能力不同，在体外培养时分布形成3种不同的细胞克隆[1]：①全克隆(holoclone)，克隆细胞集群大而圆，其内细胞成分主要是小而形态规则的干细胞，具有很强的自我增殖能力，高表达β1整合素、K14、P63等细胞标记，可不均等分裂成干细胞及短暂扩增细胞。②部分克隆(meroclone)，主要由短暂扩增细胞形成，细胞大小不等，自我增殖及分化能力存在差异，由于在向低分化细胞分化的过程中逐渐脱离了干细胞壁龛环境，这一细胞P63的表达水平明显低于干细胞。③次全克隆(paraclone)，克隆面积小且形态不规则，其内几乎均为终末分化细胞，细胞大而扁平，且高表达终末分化细胞标记物内皮蛋白(involucrin)，通常仅能维持较短的复制周期，便逐渐丧失增殖能力。

2 表皮干细胞修复皮肤软组织创伤的实验研究

表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的基础，在保持皮肤正常结构、维持表皮的自我更新和稳态方面起着重要作用。1984年首次出现应用体外培养的表皮干细胞治疗大面积皮肤烧伤的案例报道[12]，2例全身烧伤95%以上的患儿(Ⅲ度烧伤面积分别为83%和89%)，应用体外培养的表皮干细胞成功覆盖50%以上烧伤创面，同时挽救了生命。

2.1 表皮干细胞促进急、慢性创面的愈合

创伤可刺激表皮干细胞增殖分化，形成新的子细胞填充皮肤组织缺损[13,14]。在基底层完整的情况下，基底层表皮干细胞逐渐自下而上脱离壁龛，通过自我增殖分化进行创面修复。若基底层同时受到破坏，则主要依靠伤口边缘附属器内的表皮干细胞向伤口分化、增殖、迁移而进行修复功能[15]。β1整合素是表皮干细胞进行壁龛黏附的重要分子，在创伤早期表皮再生中发挥重要作用[1]。创伤后，表皮干细胞的β1整合素消失，使其失去黏附作用向创面移动，进行分裂启动修复功能[16]。在移动过程中，新生成的短暂扩增细胞高表达磷酸化P63，保持增殖功能的同时继续向表面移动，填补细胞空缺，促进创面愈合[13]。1999年，Pellegrini等[17]应用富含表皮干细胞的自体角质细胞移植治疗7例20%～45%皮肤全层烧伤，其中6例在移植术后1个月创面表皮再生覆盖达100%，1例覆盖达80%。此外，Mascre等[18]的示踪研究还显示表皮干细胞对创伤组织的修复和再生起着重要作用，其能在创面基底迅速形成克隆向创面中心扩展，仅3.5天，60%干细胞已经经历了一轮细胞分裂。同时证实表皮干细胞是创面中长期发挥作用的细胞，(3.8±0.1)细胞克隆/mm2在移植后35天密度仍可达(2.6±0.1)细胞克隆/mm2。

除了大面积烧伤和急性创伤，糖尿病溃疡等慢性难愈性创面的修复也是目前表皮干细胞治疗研究的热点。随着人口老龄化，肥胖人群增多，糖尿病的患病率逐年增长，糖尿病溃疡的发生率也持续上升，这类创口往往难以自愈，可迁延数月甚至数年。现有治疗方法包括组织工程皮肤产品、局部应用生长因子、电刺激、负压吸引等，都难以达到满意效果[13]。2016年，Yang等[19]用糖尿病溃疡动物模型进行研究，观察到表皮干细胞能够通过Notch信号传导通路促进糖尿病溃疡创面的愈合，这一通路中的Jag1能够促进表皮干细胞向创面迁移，应用Jag1转染的表皮干细胞治疗的鼠糖尿病溃疡创面在15天时明显小于未转染的表皮干细胞治疗的创面。

随着体外细胞技术的发展，利用表皮干细胞自我增殖的特性，体外培养扩增获得上皮皮片，移植于创面进行修复，从而弥补了自体皮片供区不足的缺点。经过不断的技术改进，自体扩增皮片已经成为目前治疗大面积烧伤皮损及慢性创面的可行手段[2]。2010年，Sood等[20]报道一项为期18年的临床研究，对88例大面积烧伤创面患者进行自体扩增皮片移植，分别对其移植存活率、水疱发生率、创面挛缩发生率等并发症进行3～90个月的随访，结果显示应用这一技术治疗的大面积烧伤患者，总生存率达91%(80/88)，自体扩增皮片移植的成活率高达72.7%，有66%的患者(58/88)出现创面挛缩，其中32例行挛缩松解手术。

2.2 表皮干细胞与皮肤附属器再生

表皮干细胞在伤口愈合中的作用不仅仅局限于再生形成分层的表皮，还与毛囊、汗腺等重要皮肤附属器的再生密切相关。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路是汗腺发生和发育过程中的重要信号通路，抑制MAPK/ERK通路的磷酸化在表皮干细胞向汗腺细胞分化过程中十分重要[21]。在培养基中加入PD98059可阻断ERK磷酸化，从而抑制MAPK/ERK通路，促使表皮干细胞退出干细胞群落，向汗腺细胞方向分化[22]。同时，创面底部的表皮干细胞在创伤刺激下能够大量分裂增殖并向创面迁移，在增厚的瘢痕乳头层部位形成毛囊样结构[23]。有研究表明，创面中心的表皮细胞具有更大的形态可塑性，能够与创面下方的真皮共同作用，参与创面毛囊的再生[24]。2017年，王元元等[25]将体外培养的人表皮干细胞接种在组织工程真皮上，加入不同浓度的表皮生长因子(EGF)，进行三维培养和定向诱导分化，通过HE染色及CK19荧光染色，结果表明在15～20 ng/ml浓度的EGF诱导下，表皮干细胞能形成管腔样结构，该管腔样结构由单层细胞构成的管壁和中央空腔组成，在形态学、组织学上与在体汗腺分泌部的管状结构相似，且抗CKl8和抗-CEA免疫荧光染色均表达阳性，从而证实表皮干细胞参与创面皮肤附属器的再生。

2.3 表皮干细胞与创面瘢痕调控

表皮干细胞对创面瘢痕的形成过程产生影响[26]。P63和ki-67的异常表达与瘢痕形成关系密切。Edriss等[27]对瘢痕形成时期的表皮干细胞进行染色，观察到其核蛋白P63和ki-67的表达明显增强，证实其在瘢痕形成过程中的活性增强。Wang等[28]的研究证实表皮干细胞能够下调转化生长因子β1(TGF-β1)，促进碱性成纤维生长因子(bFGF)的表达及细胞桥粒形成，与表皮干细胞共同培养的真皮细胞外基质分布良好，未见胶原束形成，且胶原mRNA和蛋白表达水平下降至46%，从而减缓皮肤纤维化的进程及缓解瘢痕形成。

3 小结

表皮干细胞研究的扩大及深入，为创面修复研究提供了新的思路。现有研究提示我们，具有自我增殖及多项分化能力的表皮干细胞在创面覆盖、皮肤附属器再生、瘢痕修复等方面有一定的研究基础及诱人的应用前景。然而目前关于表皮干细胞的临床应用研究仍然十分匮乏，大量的研究仍然停留在基础层面而缺乏临床证据支持。如何将基础研究转化为临床应用，让表皮干细胞在创伤修复领域真正发挥其作用，仍需更进一步的探索。