血小板活化标志物检测在临床研究中的应用进展

华晓东

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

血小板(PLT)是一种无细胞核、呈不规则形状的血细胞，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为10～30万/mm3)，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成等生理和病理过程中有重要作用。正常的血小板活化聚集是一种必要的防御机制，但过度活化会引起一些血栓性疾病。现代临床研究表明[1-3]，许多疾病，尤其是心脑血管疾病的发生和发展都和血小板活化状态变化有关。因此血小板功能检查是临床多种疾病诊断和研究中常用的手段之一。

血小板功能检查的方法包括血小板黏附性、聚集性及相关物质检测，有时还辅助以体内动物血瘀模型实验对评价方法进行验证。但多数血小板功能检查方法烦琐，难以标准化和规范化，同时检查过程受人员操作的影响较大[4]。

随着科技的发展，血小板生物标志物的概念引入血小板功能检测领域并逐渐被大家所接受[5]。循环血液中血小板基本处于静息状态,在各种理化和生物因子的作用下,血小板受到刺激而成为活化血小板发挥聚集作用。活化时血小板胞内的颗粒膜表面糖蛋白表达到血小板膜上,在血小板膜表面表达的这种特定糖蛋白被称为识别活化血小板的特异性分子标志物，其中最重要的是血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa纤维蛋白原受体(PAC-1)和P选择素(CD62p)。此外还有CD31、CD63、CD41、CD61、CD62等。

1 主要的血小板活化标志物

1.1 血小板活化早期标志物 PAC-1是GPⅡb/Ⅲa复合物活化后暴露的纤维蛋白原受体,即活化的GPⅡb/Ⅲa复合物，仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来，能精确地反映血小板活化的早期状态，是血小板活化早期的重要标志物。血小板活化后,PAC-1的活性表达是引起血小板聚集的最后通路,检测血小板表面PAC-1的表达量可以反映血小板早期活化情况。

1.2 特异性血小板标志物 血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白(如CD62p、CD63等)在质膜上表达，成为血小板活化后的特异性分子标志。其中CD62p为血小板α-颗粒膜糖蛋白,在静止血小板膜表面仅有极少量表达,当血小板活化后,血小板内的α颗粒膜糖蛋白通过开放管道系统迅速与胞膜融合,在平均每个血小板膜上表达10 000个左右分子,是识别活化血小板的最特异性标志物。膜糖蛋白(CD62p)和溶酶体蛋白(CD63)均为活化血小板的生物标志物，但CD62p特异性更强，被认为是血小板活化检测的“金标准”。

1.3 泛血小板标记物 如CD41(GPⅡb)、CD61(GPⅢa)，既可与活化血小板结合，也可与静止血小板结合。可用于在全血细胞中标记出血小板，并通过与其他标记物的联合使用，在标记出的血小板中区分出活化和未活化的血小板。

2 血小板活化标志物的检测方法

活化血小板生物标志物可采用多种方法进行检测[6]，如酶联吸附试验法(ELISA)、放射免疫试验法(RIA)、免疫比浊法(ITA)等，但大多存在线性较窄、可比性差、干扰因素多等缺点，而流式细胞术作为一种高效、快速、多参数分析的先进技术，可以非常灵敏地检测到活化血小板膜表面糖蛋白分子的变化，从而更精确地判断血小板的活化程度和功能状态，进而可以准确地诊断或预测疾病的发生和进展[7]。该方法具有操作简便、检测血小板亚群灵敏度高、用血量少、无放射性污染等优点。同时随着技术的发展，检测的敏感性和特异性也不断提高,使得对血小板状态的动态监测成为可能，更适用于心脑血管疾病临床诊断和进展预测。

3 血小板活化标志物的临床应用

3.1 冠心病 冠心病的主要病理基础是动脉粥样硬化(AS),由于AS的发生，多种因素均可造成血小板的激活。其中血管内皮细胞损伤,血管内皮下胶原暴露；冠脉内的脂质斑块造成局部血流动力学改变,产生高切变；脂质斑块发生溃破,脂质暴露于血液均可引起血小板活化，因此AS患者是血栓形成的高危患者,各种血小板标志物均处于高表达状态。准确测定血小板生物标志物表达量对冠心病的诊断、预防、疗效监测及预后判断都有重要意义。吴志福[8]根据2004年美国心脏病学会/心脏病协会颁布的《急性冠脉综合征(ACS)诊断标准》检测了104例ACS患者的血小板膜糖蛋白表达和血小板聚集功能。发现在ACS状态下，CD62p和CD63可被凝血酶活化，使其在血小板表面高表达，而经氯吡格雷维持治疗后二者表达显著降低，这与血小板聚集率检测结果完全一致，提示CD62p和CD63表达对ACS的诊断有明显提示作用。另一项研究检测了66例ACS患者的外周血中CD62p、PAC-1在治疗前后的表达，同期以年龄、性别相匹配的健康人22例为对照组[9]。结果显示ACS患者体内血小板处于高度活化状态，治疗后CD62p、PAC-1表达率明显降低，且与血浆黏度、纤维蛋白原浓度呈正相关,显示CD62p、PAC-1的变化可作为血栓疾病的病情监测指标。

张文超等[10]选择38例符合WHO诊断标准的初治的冠心病患者，采用自身对照分析法，FCM测定经典药物阿司匹林治疗前后的全血中血小板表面糖蛋白(CD62p/PAC-1)的表达率。结果CD62p和PAC-1的表达能够被阿司匹林明显抑制,显示该指标对抗血栓形成效果的评价作用明确，通过对CD62p、PAC-1的监测可以对抗血小板药物的选择提供指导。郭壮波等[11]采用FCM测定23例急性冠脉综合征(ACS)、52例慢性心肌缺血综合征(CIS)患者及22名健康对照者的CD62p和PAC-1表达率，结果ACS组PAC-1表达明显高于CIS组，而CD62p未见差异。PAC-1是血小板活化的早期指标,可能更适合用于ACS患者的诊断和治疗效果评价。同时已有随机、安慰剂对照的临床试验证实[12],GPⅡb/Ⅲa受体拮抗可以有效地抑制血小板聚集,减少亚急性血栓形成，检测PAC-1表达的变化能够较早地反映血小板的活化情况。

3.2 心肌梗死 心肌梗死是心血管疾病中最常见的疾病之一，心肌梗死的产生、进展程度与血小板活化形成血栓密切相关，可以通过CD62p含量分析来准确预测。陈运平[13]选取确诊的心肌梗死患者143例及健康对照组50例，应用流式细胞仪测定CD62p的水平变化。结果心肌梗死患者CD62p含量显著高于对照组，表明CD62p高表达是心肌梗死患者的一个重要发病指标。

3.3 下肢深静脉血栓 深静脉血栓形成(DVT)是指血液在下肢深静脉腔内不正常凝结，阻塞深静脉管腔，导致静脉回流障碍，引起相应的血栓性疾病，血小板活化在其中也起着重要的作用。DVT诊断的金标准是深静脉造影，但不能用于早期诊断，而且属有创检查。叶智宾等[14]选择下肢深静脉血栓形成患者80例，用药前后检查血小板计数、凝血酶原时间、血小板活化因子，并以下肢深静脉彩超检查评价临床疗效。结果DVT患者血浆CD62p、CD63、PAC-1的水平较对照组明显升高，溶栓、抗凝治疗能显著降低血浆中上述指标水平。表明CD62p、CD63、PAC-1的水平可以作为DVT患者的诊断和治疗效果评价的可靠指标。

3.4 川崎病 川崎病(KD)又称黏膜皮肤淋巴结综合征(MCLS),目前认为是一种由感染原触发的免疫介导性全身性血管炎，病死率约为1%～2%,其中60%以上死于心肌梗死。近年来血小板异常活化理论在KD的病生理研究中越来越受到重视。庞毅等[15]测定了20例川崎病患儿发病1周(治疗前)、2周、3周、4周时血小板膜CD41、CD42a、CD61、CD62p、CD63的表达，观察其与冠状动脉损伤形成之间的关系。结果川崎病患儿发病4周内血小板膜糖蛋白CD41、CD42a、CD61、CD62p、CD63的表达量均高于正常对照组。其中有冠状动脉损伤的川崎病患儿CD62p的表达量明显高于无冠状动脉损伤的川崎病患儿。因此可以认为血小板高度活化,血液呈高凝状态是川崎病病理生理的重要表现，而检测CD62p是否出现明显增高可以作为川崎病患儿冠状动脉损伤的确诊指标之一。

3.5 急性脑梗死与进展性卒中 急性脑梗死(ACI)是常见脑血管疾病，其发病机制是由于血管粥样硬化和血栓形成，血小板处于黏附状态，造成脑部小动脉缺血、缺氧引起局部脑组织软化坏死，因此血小板活化是ACI发生发展的重要危险因素。通过检测血小板生物标志物的表达水平，可以对血栓的发展状态进行判断，帮助医生进行确诊并指导临床用药，尽快采取措施延缓脑血栓的发展，对降低脑血栓的发生率，提高患者生存率有重要意义。有研究通过检测ACI患者血浆CD62p表达率，并与高危组及正常人组进行对照研究，对CD62p与脑梗死的关系进行分析[16]，结果发现CD62p阳性表达率5.2%为判定急性脑梗死的限值，判定的敏感度92%，特异度95%，阳性预测值98%，阴性预测值73%，符合率(正确率)92%。CD62p的阳性表达率越高提示病情越重，当CD62p高于5.2%时，发生脑梗死的可能性极大，为进一步寻找脑梗死早期筛查指标奠定了基础。陈秋月等[17]用流式细胞术检测76例动脉粥样硬化性(CA)脑梗死患者及53例健康体检者全血血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p阳性率,并同时进行颈动脉彩色多谱勒超声检查。结果CA脑梗死患者血小板活化程度明显增高，与彩超显示的病情进展相关性良好。提示PAC-1、CD62p在CA脑梗死发病中及梗死后病程发展监测中均可能起着重要的作用。许海霞等[18]选择80例脑梗死急性期患者，分别于治疗前及治疗后7 d和14 d评定神经功能和测定血小板活化产物CD62p、PAC-1含量进行比较。显示脑梗死急性期经溶栓治疗后，可降低血小板活化标志物表达，同时神经功能明显改善，表明CD62p、PAC-1含量测定对脑梗死进展和预后监控效果明显。林丽芳等[19]用流式细胞术检测急性脑梗死组80例和对照组60例外周血单核细胞、CD14、CD42a双阳性细胞所占的百分比，并对脑梗死患者进行临床评价。急性脑梗死早期单核细胞与血小板聚合物CD14、CD42a表达明显增高，且与病情严重程度明显相关。因此检测单核细胞与血小板聚合物CD14、CD42a水平对于脑梗死患者早期诊断及预测病情轻重具有重要的临床应用价值。一项回顾性研究[20]分析了收治的72例急性脑梗死患者，选取同时期健康体检的75例为对照组，观察其血小板聚集性和血小板活化指标含量变化情况。结果急性脑梗死患者血小板活化水平明显升高，聚集功能明显增强，各指标含量与病人临床表现明显相关。另一项研究通过全血流式细胞术检查50例脑血栓患者血小板活化标志物α颗粒膜糖蛋白(CD62p)、溶酶体膜糖蛋白(CD63)的阳性率，并与健康者进行对比[21]，也充分验证了上述结果。

进展性卒中(PS)是指发病后患者神经功能缺损症状在48 h内进展或呈阶梯式加重，脑血管病中有1/4以上的脑梗死为PS,其病死率高。在PS的治疗中，早期发现是治疗的关键。在两项分别检测37例PS患者、40例稳定型脑梗死患者和45名健康对照者[22]以及152例急性脑梗死患者和30例健康对照者[23]外周血血小板膜糖蛋白的研究中，显示不同原因的脑梗死均与血小板膜糖蛋白密切相关。同时发现脑梗死患者CD62p和PAC-1表达与临床神经功能缺损程度评分均存在显著正相关性，提示CD62p和PAC-1表达量越高，脑卒中病情越重。表明脑梗死患者体内血小板活化程度明显增高，血小板活化是脑卒中早期治疗或二级预防的重要靶点，而CD62p、PAC-1表达可以作为反映脑梗死病情变化、预测预后的敏感指标。

3.6 脓毒血症 脓毒血症是由于感染引起的全身性严重反应综合征，其发病机制目前还没有准确的定论，但凝血系统的活化会明显加重脓毒血症患者病情的发展，而血小板在炎症和凝血间占据着最主要的作用。黄君华等[24]检测了23例器官功能正常、17例器官功能不全的脓毒血症患者的外周血中血小板膜糖蛋白含量，并以正常人为对照，发现脓毒血症患者CD62p、CD63均高于正常人，外周血中血小板明显处于高度活化状态，其活化程度与患者病情呈正相关。提示CD62p、CD63可以作为患者脏器损伤程度的有效指标之一。另两项将脓毒症患者按急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分分组的研究[25，26]也显示随着APACHEⅡ评分升高，患者CD62p、CD63表达均上调。在脓毒症患者发病24 h内CD62p明显增加,CD62p水平与APACHEⅡ评分呈显著正相关,而随着脓毒症患者病情的加重，CD63阳性表达率与正常对照组比较也显著升高，与APACHEⅡ评分也呈显著正相关,故说明监测脓毒症患者血小板CD62p和CD63水平在一定程度上反映脓毒症患者的病情发生和进展程度,并对判断预后有一定的价值。同时提示在脓毒症早期,通过拮抗血小板的异常活化和抗凝治疗,可以改善患者症状,为脓毒症治疗提供了一种新手段。

3.7 肿瘤 临床研究表明[27]，恶性肿瘤患者普遍存在高凝状态。高凝状态也称为血栓前状态，是由多种因素共同引起血管内皮细胞损伤以及凝血、纤溶、抗凝系统等功能失调，进而引起肌体血液凝固性增高，易于形成血栓。在晚期肺癌患者中，静脉血栓栓塞症的发生率达13.6%，高凝状态给肿瘤患者临床治疗带来了困难，增加了病死率，因此，临床上监控和改善恶性肿瘤高凝状态在肿瘤的综合治疗过程中不容忽视。王为光等[28]选择急性白血病初次确诊未治患者28例，急性白血病诱导后早期完全缓解患者16例，长期完全缓解患者(缓解期达2年以上)10例，正常对照组30例。用流式细胞仪检测其全血中PAC-1、CD62p、CD63水平，观察其在二磷酸腺苷(ADP)激活前后表达的差异。急性白血病初诊未治时外周血血小板活化增多，ADP激活后活化功能降低，黏附、聚集功能减低，诱导后早期完全缓解阶段血小板聚集、黏附、活化功能较初诊未治时有所恢复，但仍处于异常状态，长期完全缓解阶段血小板膜糖蛋白表达正常，其血小板功能亦恢复正常。血小板的黏附、聚集和活化功能可通过其表面膜糖蛋白的表达来充分反映。因此对预防急性白血病患者出血的研究与防治具有重要价值。

3.8 先兆性子痫 易正山等[29]检测了25例正常人与20例正常孕妇及22例先兆子痫孕妇静息态及ADP活化后CD41a、CD62p、CD63等血小板膜糖蛋白的表达量，结果先兆子痫孕妇组CD62p、CD63表达量均较正常孕妇组显著增高，而CD41a表达无显著性差异。因此通过监控产妇体内血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的表达水平,可以达到早期诊断先兆子痫的效果。

3.9 急性一氧化碳中毒 急性一氧化碳中毒(ACOP)是一个世界性问题,在我国ACOP的发病率及死亡率均居高不下。ACOP患者尸检后脑部小血管可见到充血、血栓、出血等病理改变，提示脑部小血栓形成在CO中毒脑病的发展过程中有着重要作用。侯晓敏等[30]研究了急性一氧化碳中毒(ACOP)患者血小板膜糖蛋白的变化。结果ACOP组CD63、PAC-1和CD62p的表达水平均高于正常对照组。且CD63和PAC-1在一段时间内将维持较高水平。通过监控这些血小板生物标志物水平，可以指导ACOP后抗血小板活化治疗时间并为ACOP提供预测预后的敏感指标。

总之，血小板活化与多种疾病相关，其活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，而应用FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况已成为检查血小板功能的一种新手段，对血小板活化相关疾病的诊断、治疗、监测有着极其重要的作用。