CCR6、Th9细胞、Th17/Treg细胞失衡在大鼠肺纤维化中的表达及意义

李树民,鲍文华,赵艳景,马雪梅,杨晓东,梁姗姗

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯154002)

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种病因复杂，发病机制尚不十分明确的肺部间质性疾病，近年来发病率、死亡率均逐年增高。其主要病理改变呈现为弥漫性肺泡炎及肺成纤维细胞灶形成、细胞外基质过度沉积[1]。前期试验中针对CCR6-CCL20轴、Th9细胞相关因子与肺纤维化发生机制的关系已有所研究[2，3]，而近年来有关Th17/Treg失衡的研究备受关注。相关文献[4]指出自身免疫性疾病发生的重要原因之一为Th17/Treg比例失衡，Th17 与Treg之间保持动态平衡对于机体内环境的维持意义重大。本研究拟通过建立大鼠肺纤维化模型，观察CCR6、Th9相关因子及Th17/Treg失衡在大鼠肺纤维化模型的肺组织中变化特点，探究CCR6、Th9相关因子和Th17/Treg比例失衡与肺纤维化发病机制的关系和意义，为临床治疗肺纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂63只SD大鼠(健康雄性清洁级)，体重约( 220±30) g，购买于大连医科大学实验动物中心，清洁级标准饲养(合格证号:scxle(黑) 2013007)；盐酸博来霉素(美国Invitrogen公司)；地塞米松注射液(购置于辉瑞制药有限公司)；10%水合氯醛、乙醇、蒸馏水等(天津化学试剂三厂生产)；Anti-CCR6 antibody一抗、SP二抗(美国abcam公司)；IL-9抗体(Abcam公司提供)； PE-Cy5 anti-Rat CD4(大鼠抗小鼠 CD4单克隆流式抗体，美国BDP harmingen);PE anti-mouse IL-17及同型对照(大鼠抗小鼠 IL-17单克隆抗体，美国 BDPharmingen )；PE anti-rat Foxp3(大鼠抗小鼠Foxp3 单克隆抗体)及同型对照(美国ebioscience)；Cat15596-026(Invitrogen)；Trizol溶液，DNA纯化试剂盒:引物(TaKaRa合成)；逆转录试剂盒(Cat K1622 购自Fermentas公司)；RT-PCR试剂盒、Trizol试剂、SYBR Green荧光定量 PCR试剂盒( Hai Gene);DAB显色试剂盒(中杉金桥)。

1.2动物分组按随机数字表将63只雄性SD大鼠分为三组:生理盐水对照组(N组)、肺纤维化模型组(F组)、地塞米松治疗组(D组)，每组各21只。

1.3制作模型及标本采集以10%水合氯醛溶液(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，将大鼠以仰卧姿势固定在鼠板上后，颈部备皮消毒，沿正中线剪开颈部皮肤，分离组织充分暴露气管，F、D组快速推入BLM(0.50 mg/100 g)于大鼠气管分叉处，N组注入同体积等渗生理盐水。然后将大鼠直立，以及迅速顺逆时针旋转鼠板，皮肤缝合，清洁级饲养。从第2 d开始，D组大鼠每日给予腹腔内注射地塞米松( 0.3 mg/100 g)，N、F组注入同体积生理盐水。分别在造模后第 7、14及28 d,采用随机方式从三组大鼠中各抽取7只，处死后留取肺组织。

1.4肺组织病理改变对留取的各组肺组织行HE染色，观察肺组织炎症程度及纤维化程度变化。

1.5检测肺组织CCR6、IL-9表达水平采用免疫组化法检测各组肺组织CCR6、IL-9表达水平，肺组织胞质中出现棕黄色颗粒提示切片阳性结果；胞质中无棕黄色反应物提示阴性结果(细胞核染色为蓝色)。据Hwang I等学者[5]研究标准，400倍显微镜下取景，使用image proplus系统( 细胞图像分析) 方法对阳性结果的平均灰度值行数值评分。

1.6检测PU.1mRNA离心BALF，留取沉淀,Trizol法提取RNA，逆转录为cDNA，荧光PCR法检测PU.1mRNA表达水平，引物序列：PU.1:(上游)5′-TGCTTCCCTTATCCACCCTTG-3′(下游) 5′-TCTTCTTGCTGCCTGTCTCC-3′；GAPDH:(上游)5′-AACTCCCATTCTTCCACCTTT-3 ′(下游)5 ′-CTCTTGCTCTCAGTATCCTTG -3′。

1.7肺组织Th17、Treg细胞表达检测采用流式细胞术方法检查分析肺组织Th17、Treg细胞表达情况。

2 结果

2.1显微镜下观察HE染色肺组织病理改变N 组大鼠呈现正常肺泡及肺间质结构，无炎症细胞及纤维蛋白沉积。F组、D组镜下病理改变基本相似，与N组对比，B组大鼠第7 d肺组织出现显著炎症细胞浸润，如中性粒细胞、单核巨噬细胞等，肺间质充血、水肿，成纤维细胞计数增多；第14 d、第21 d肺组织炎症逐渐吸收，成纤维细胞逐渐增多，胶原纤维逐渐增生、沉积，肺泡间隔逐渐增宽，肺泡逐渐萎缩、消失。但无论是肺组织炎症浸润程度，还是纤维蛋白沉积程度，同一时间点，D组较F组肺组织病变严重程度有所减轻。

2.2检测各组大鼠肺组织中CCR6、Th9相关因子、Th17及Treg细胞表达水平

与N组相比，F、D组各时间点检测指标CCR6、PU.1mRNA、IL-9蛋白质含量、Th17细胞百分率结果明显增高(P<0.05)，具有统计学意义。检测结果于第 7 d时达到最高值，第14 d、第28 d呈现逐渐降低趋势，但总体上仍高于N组。D组、F 组两组变化趋势相似，但D组检测结果低于同时间点F组值、明显高于N组值，差异存在统计学意义(P<0.05)。F、D组各时间点Treg细胞百分比与N组相比结果降低(P<0.05)，有统计学意义，并且结果呈现逐渐降低。见表1。

表1 不同时期三组大鼠肺组织各指标表达情况

注：与N组比较，&P<0.05；与F组比较，@P<0.05

2.3CCR6细胞表达量与IL-9、Th17、Treg细胞计数、Th17/Treg比例相关性的分析CCR6、Th9、PU.1mRNA表达水平与Th17有显著正相关性，与Treg有显著负相关(P均<0.01),见表2。

表2 相关r值

3 讨论

PF好发人群多为老年人，作为一种慢性呼吸道疾病间质性改变，早期以肺部炎症性改变，晚期以纤维蛋白沉积、肺组织纤维化病理表现为主，患者多以呼吸困难、干咳为主要症状，活动后加重，晚期严重乏氧，心肺功能降低，严重影响生活质量，被称为不死的癌症。目前发病机制尚未完全明确。本研究以Th17/Treg 失衡为切入点，分析前期研究中趋化因子受体CCR6、Th9相关因子与Th17/Treg 失衡在肺纤维化发病机制中的关系。

2005年,Harrington[6]等人提出Th17(CD4+-IL-17+辅助性T细胞)细胞是一种CD4+效应性T细胞亚群在介导炎症反应中起到重要的作用，在炎症状态下CCR6可趋化Thl7细胞至肺部、皮肤等其他组织[7]；Th17细胞，由TGF-β和IL-6、IL-23介导下激活STAT3通路诱导高表达特异性转录因子RORγt，从而分泌IL-17,通过CCR6/CCL20趋化轴，被诱导至病变组织部位，激发炎症反应[8,9]，本次研究中发现，与N组相比，F、D两组各时期CCR6、Th17指标结果明显增高，由于第7 d时大鼠肺纤维化模型炎症反应最明显，故检测结果在此时达到最高值，并且CCR6与Th17呈正相关，说明Th17可能通过与趋化因子受体CCR6相互作用参与肺纤维化发病过程。与鲍文华[10-11、2]等人关于Th17细胞对肺纤维化大鼠模型中的表达及意义研究一致。

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)是对炎症反应起拮抗作用的另一特殊类型T细胞，在维护免疫平衡及调节机体炎症反应中起到重要作用。Sayour EJ等[12,13]学者认为Treg与特发性肺纤维化以及化学因素诱导的肺纤维化密切相关。大量实验研究证实多种疾病例如自身免疫性疾病、肿瘤、炎症反应以及移植排斥等的发生发展与Th17、TH1/TH2及Treg细胞亚群之间相互作用有关。正常机体内存在着Th17/Treg动态平衡，Th17/Treg失衡可促进自身免疫性疾病炎症反应的发生[14]。而关于Th17/Treg 失衡与肺纤维化发病机制的研究甚少。赖小映，钟小宁[15]认为Th17/Treg失衡可能加重肺纤维化免疫炎症，促进肺部胶原纤维的沉积。CCR6主要由朗汉斯细胞，记忆性T细胞、B细胞、CD+25CD+4调节T细胞表达，CCR6与CCL20结合后，可募集未成熟树突状细胞(DCs)、专职的抗原提呈细胞(APCs)、成熟DCs至炎症反应部位[16]。本研究结果显示F、D两组相对于N组各时期Treg细胞百分比降低、Th17/Treg比值结果增高，并且CCR6与Treg相关性分析呈负相关、与Th17/Treg呈正相关，推断CCR6可能参与Th17/Treg细胞失衡致大鼠肺纤维化的形成过程。

TH9细胞是以分泌IL-9、IL-10细胞因子为主的新型 CD4+T 细胞亚群，VeldhoenM,、DardalhonV[17,18]等人证实了“Th9”细胞，为已有的包括辅助性T细胞1型(Thelpercell1,Th1)、2型(Th2)、Th17和Treg在内的Th细胞亚群添加新成员。PU.1作为Th9细胞特异的转录因子，通过IL-9 基因组蛋白乙酰化从而促进 Th9 细胞表达[19]。TH9细胞参与机体多种炎症反应性疾病，如支气管哮喘、过敏性鼻炎、溃疡性结肠炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮等。本研究指出B、D两组相对于N组各时期IL-9、Th17/Treg比值结果明显增高，并且IL-9与Th17/Treg相关性分析呈正相关，提示TH9细胞可能参与肺纤维化Th17/Treg失衡理论的调节机制。Veldhoen M[20]等在研究Th9细胞的功能时发现，存在RAG-1缺陷小鼠，即便缺失Treg细胞,也可通过来源于Th9细胞的IL-9作用于Treg细胞，同时发挥促炎功能使组织炎性反应更加严重。与本实验研究结果相似。

总之，与对照组比较，CCR6、Th9相关因子、Th17、Th17/Treg在大鼠肺纤维化模型组中肺组织表达量显著增高，与肺部炎症、纤维化程度密切正相关,Treg细胞百分率降低；CCR6、Th9相关因子与Th17相关性分析为正相关，与Treg细胞相关性分析呈负相关；故如何通过抑制CCR6细胞、Th9相关因子分泌及有效调节Th17/Treg细胞平衡，从而控制炎症反应，调节机体的免疫状态，将为肺纤维化临床治疗提供新的研究方向。

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