Survivin自身抗体在非小细胞肺癌中的临床意义与诊断价值

修雨婷，王爱馥，张 奇，刘林林

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

肺癌是发病率最高的恶性肿瘤,也是癌症死因之首[1]，中晚期患者5年生存率仅 10% 左右，但有临床证据显示 I期肺癌患者 10年生存率可高达 90% 以上。由于早期患者缺乏特异症状，患者首次就诊时大多为中晚期，因此建立能够用于大范围人群早期发现肺癌的指标和方法,是提高其早期发现率 ,从而降低死亡率的关键问题。

我们之前的研究发现，几种循环自身抗体与癌症密切相关。例如食管鳞癌患者CD25自身抗体水平、非小细胞肺癌患者P16自身抗体及宫颈癌患者FOXP3自身抗体水平与健康对照者相比显著升高[2-4]。癌症患者自身抗体异常分泌的机制尚未完全阐明，但大多数学者认为免疫监视是自身抗体异常表达的主要原因。免疫原性部分来源于肿瘤特有的新抗原的产生，但更大程度上来源于肿瘤细胞中异常表达的自身抗原，这些异常抗原被称为肿瘤相关性抗原(TAAs)，可被免疫系统识别，并通过产生自身抗体来实现杀死肿瘤细胞的目的[5]。基于这种抗原-抗体反应，在早期肿瘤诊断中，针对TAAs的自身抗体的检测比直接TAAs检测更敏感。

Survivin位于染色体17q25，是凋亡抑制剂(IAP)家族的成员，它是一种能够调控细胞分裂、抑制凋亡和促进血管生成的多功能蛋白质[6]。由于在成熟器官或组织癌细胞中显著的特异性过度表达，Survivin近年来成为癌症早期诊断热门的生物标志物。本研究应用改良的ELISA方法检测非小细胞肺癌患者血清中Survivin循环自身抗体水平，探讨其在267例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中可能存在的临床意义及诊断价值。

1 材料与方法

1.1研究对象

研究对象为267例吉林大学中日联谊医院首诊为肺癌的患者，平均年龄60.0±9.8岁，并具备完整临床资料信息，确诊及分期依据为影像学及病理学检查，在进行任何抗癌治疗之前采集血样。同时收集362名健康受试者血清，平均年龄50.7±8.4岁，排除任何恶性肿瘤史，肺癌组与对照组均无严重的自身免疫病病史。入组对象均为中国汉族，并签署书面知情同意书参与本研究，实验内容获得吉林大学伦理委员会批准。

1.2实验方法

Survivin蛋白(纯度>95%)以20 μg/mL溶于包被缓冲液中，100 μL/孔，4℃静置过夜；弃去孔内液体，200 μl洗液洗板3次，包被缓冲液稀释谷氨酸至 10 mg/mL，每孔加样 200 μl，37℃孵育1 h；200 μl 洗液洗板3次，BSA分析液稀释肺癌患者及健康对照者血清至目标浓度 1∶200，每孔加样 100 μl，37℃孵育1.5 h；200 μl洗液洗板3次，每孔100 μl 1∶40 000分析液稀释的羊抗人IgG-HRP， 37℃孵育1 h；200 μl洗液洗板3次，100 μl TMB显色液，37℃避光显色30 min；50 μl终止液终止显色反应，自动酶标仪上读取450 nm-620 nm处OD值。BSA分析液作为阴性对照孔，200份健康人血清混合的QC作为阳性控制孔。

1.3自身抗体检测

本研究通过对目的蛋白结构的分析和表位预测设计，把多肽片段而不是传统的重组蛋白作为酶标板包被抗原。应用改良的ELISA方法检测Survivin特异性自身抗体,并将特异性结合指数(SBI)表达循环自身抗体的水平：SBI=[Survivin(OD)-NC(OD)/ QC(OD)-NC(OD)]。

1.4数据分析

本研究应用Microsoft Excel 2010构建SBI值数据库，并计算mean±SD 值作为最终数据。 采用IBM SPSS Statistics 21.0进行Student t检验，比较肺癌患者组与对照组之间的SBI差异，并进行ROC曲线分析。

2 结果

2.1肺癌组患者与健康对照组Survivin自身抗体表达水平

Survivin自身抗体在肺癌组(mean±SD 1.027±0.521)表达显著高于对照组(0.859±0.279，P=0.000)。进一步比较肺癌不同期别Survivin自身抗体的表达，结果显示：Ⅰ期-Ⅱ期(1.067±0.710)肺癌中Survivin自身抗体的表达虽高于Ⅲ-Ⅳ期(0.993±0.270)，两组间差异无统计学意义。

2.2ROC曲线分析

肺癌中Survivin自身抗体AUC为0.713(SE=0.020,95%CI 0.673-0.753)。在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌中，AUC值为0.731(SE=0.023,95%CI 0.687-0.776)，90%特异性对应的敏感性为18.7%；Ⅲ-Ⅳ期肺癌中，AUC值为0.697(SE=0.024,95%CI 0.651-0.744)，90%特异性对应的敏感性为16.7%。

表1 非小细胞肺癌患者组和健康对照组Survivin自身抗体的表达水平

表2 非小细胞肺癌患者组和健康对照组Survivin自身抗体表达的ROC分析

3 讨论

许多研究证明TAAs自身抗体的异常升高与癌症的发生有关。Wang et al.[7]发现前列腺癌的检测中，联合抗原检测与单一前列腺特异性抗原(PSA)相比灵敏度和特异性显著升高。且去除“免疫原”后，5例接受前列腺切除术的患者表达的自身抗体减少。在另一项研究中，Joseph et al.发现骨桥蛋白(OPN)循环自身抗体可作为CT筛查的辅助诊断生物标志物，以提高早期NSCLC和高危组患者的特异性[8]。此外NSCLC期别越晚，OPN自身抗体水平越高。一项评估谷胱甘肽S-转移酶1(GSTO1)在食管鳞癌诊断价值的研究中，食管鳞癌患者自身抗体对GSTO1的阳性百分比为44.8%，而健康者中仅为6.7%[9]。总的来说，研究者认为自身抗体水平的改变有助于诊断癌症。

图1 非小细胞肺癌患者组和健康对照组Survivin自身抗体的表达ROC曲线

Allen et al.[10]首先发现IAP的过度表达可导致乳头状瘤转化为鳞状细胞癌的可能性增加,但在之后的试验中他们发现，Survivin水平较高的小鼠乳头状瘤形成较少,这表明Survivin蛋白参与肿瘤进展而不是其产生。还有许多研究证实，食管癌、肺癌、乳腺癌和肝癌患者Survivin蛋白的表达明显改变[11-14]，Survivin在癌症的进展中起着至关重要的作用，可以作为早期发现的潜在生物标志物。癌症患者Survivin上调机制尚未完全了解，有研究表明，Survivin蛋白的上调可阻止细胞程序性死亡，并使得癌细胞通过G2-M检查点，进而繁殖生长[15]。

Vaios et al.报道肺癌患者Survivin自身抗体的过表达频率为7.7%，健康对照组为2.6%和2%[16]。与其结果一致，我们同样发现Survivin自身抗体在肺癌患者中显著过表达，90%的特异性对应敏感性为17.2%。同时我们进一步检测了Survivin自身抗体在不同期别肺癌的表达趋势，结果表明，随着肺癌的进展，自身抗体水平逐渐降低。这些结果进一步揭示了自身抗体对肺癌早期诊断中Survivin的潜在作用。虽然Survivin自身抗体在肺癌中的敏感性不能满足早期检测的临床要求，但与其他TAAs自身抗体的联合可以提高检测灵敏度,多种TAAs自身抗体联合检测也是目前提高肿瘤诊断敏感性和特异性的主要手段。

多种TAAs自身抗体的联合检测可以有效提高诊断敏感性和特异性，但TAAs成员应具有相对优越的特异性和灵敏度。早期肺癌诊断试剂盒EARLY-CDT作为基于TAAs自身抗体理论的第一个试剂盒包括7个TAA，其灵敏度达到49%。 Survivin的线性抗原肽能否作为肺癌早期诊断试剂盒的候选成员，可以提高检测灵敏度和特异性，但仍需进一步验证。

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