嗜酸乳杆菌zrx02的plnD基因克隆及生物信息学分析

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(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003; 2.云南商务信息工程学校,云南昆明 650051)

群体感应(Quorum sensing,QS)也称为通讯机制,是一种与群体密度相关的机制,通过群体感应系统,细菌可以控制自身或其他细菌的细胞群体密度和调控特定基因的表达[1],如葡萄球菌致病基因的表达、乳酸菌细菌素的产生、芽孢杆菌生物膜的形成等[2-4]。目前已有研究者发现,细菌群体感应与细菌素的产生机制有密切关系,细菌素的产生依赖于自诱导肽,只有自诱导肽达到一定的浓度细菌素才会产生,这个浓度阈值依赖于细胞的转录活性和细胞的数量,也就是依赖群体感应系统[5-7]。

乳酸菌所产生的细菌素分为两大类,Ⅰ类称为羊毛硫细菌素(Lantibiotics)家族,Ⅱ类称为非羊毛硫细菌素家族,目前研究表明嗜酸乳杆菌产生的细菌素大多属于Ⅱ类细菌素[8],该类细菌素分子量大多数小于10 kDa,由天然氨基酸组成,转录后不修饰,属于稳定的疏水肽,并由QS系统调控。研究者在产细菌素的基因中证实了pln基因座有5个可诱导操纵子,分别是plnABCD、plnGHSTUVW、plnJKLR、plnEFI和plnMNOP[9],其中plnABCD编码产物有自诱导肽plnA,跨膜组氨酸蛋白激酶plnB和两种高度同源的反应调节器plnC和plnD[10-13],随着细胞的生长,自诱导肽会在细胞膜外积累,当积累到一定浓度会激活细胞膜上的plnB蛋白并与其结合,在保留的组氨酸残基处自磷酸化,磷酸基团被运输给plnC和plnD蛋白,被磷酸化后的调节因子特异性结合到目标启动子,两种反应调节器开始起作用,其中plnC激活目标蛋白的表达,plnD抑制目标蛋白的表达,起到调节目标基因的表达作用,使自诱导肽和细菌素产生[13]。

表1 相关基因引物序列Table 1 Primer sequence of related genes

乳酸菌产生的细菌素可以广泛地抑制革兰氏阳性菌和部分真菌,目前已经有乳酸菌素应用于食品的防腐处理,乳酸菌能产生多种细菌素,Indira从日常废水分离出乳酸菌,并利用该菌分离纯化出多种细菌素[14],Ge从副干酪乳杆菌HD1-7中纯化到一种新的细菌素并用于食品防腐[15];Ekblad分析了两种多肽类细菌素的性质和结构[16]。乳酸菌产生多种细菌素主要依赖于存在的群体效应,副干酪乳杆菌克隆到prcA基因,该基因是副干酪乳杆菌群体效应相关基因-自诱导肽编码基因,负责细菌素生成的调控[17];从杏鲍菇和海带分离的乳酸菌中克隆到Lcn972A基因和Nisin-like基因[18-19]。pln基因座的DNA 片段组成5～6个操纵子,基因座的保守部分有plnABCD调控操纵子,编码一个群体感应系统,这一感应系统在pln基因座表达所有相关蛋白时是必须的,不用菌株的pln操纵子和群体效应对细菌素的合成都有影响,但是关于这些操纵子的生物功能研究还比较缺乏,其中的plnD作为反应调节器起着重要的作用,研究更少。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属,是一类无芽孢革兰氏阳性杆菌,菌体以单个、成双或者短链状排列,形态呈细长杆状,同型发酵乳酸,不能液化明胶,能够释放乙酸、乳酸和一些抑制有害菌生长的细菌素,但是对于该菌的群体效应研究较少。所有pln启动子区域都包含一段保守的直接重复序列,这些保守的直接重复序列是plnD结合序列[20-21],是研究群体感应的重要内容,但是目前对调节因子plnD相关研究比较缺乏,因此本研究对嗜酸乳杆菌zrx02中plnD基因进行克隆,并用生物信息学方法对该基因的理化性质、空间结构等方面进行预测和分析,为嗜酸乳杆菌群体感应系统生物调控细菌素合成机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌 由本实验室从泡菜中自行分离保存,编号为zrx02;大肠杆菌DH5α上海生工生物有限公司;pMD-19T质粒 大连TAKARA生物有限公司;MRS液体培养基(蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42.0 g、硫酸锰0.25 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐温80 1 mL、蒸馏水1000 mL,微调pH6.5)用于嗜酸乳杆菌zrx02的培养;LB培养基(液体培养基:蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0;固体培养基:固体培养基加琼脂15 g/L)用于大肠杆菌DH5α的培养;Taq DNA polymerase、氨苄青霉素 大连TAKARA生物有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽屉试剂盒 上海生工生物有限公司。

101-3ABS电热鼓风干燥箱 北京市用光明医疗仪器厂;RP1000910059可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司;SW-CJ-1D单人单面垂直净化工作台 苏州净化仪器有限公司;SHP-250型生化培养箱 上海三发科学仪器有限公司;ZHWY-211C恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制作有限公司;立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;95-2磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司;JA2003电子天平 上海浦春计量仪器有限公司;Powerpac通用电泳仪 美国Bio-Rad公司;Tanon 4200凝胶成像仪 上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计plnD基因的PCR合成引物参考文献[11],扩增plnD基因引物序列如表1所示,产物大小预测值为414 bp,16S基因引物序列如表1所示,设计的引物在上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2plnD基因克隆 将保藏的嗜酸乳杆菌株划线于MRS固体培养基上37 ℃培养24 h,接种于MRS培养液中,37 ℃振荡培养(200 r/min)18 h,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌的基因组DNA作为PCR的模板,对细菌素相关基因进行PCR检测。反应体系为25 μL,包括DNA模板1 μL,10×PCR 缓冲液2.5 μL,dNTP 2 μL,Mg2+1.5 μL,上游引物plnD-F 1 μL,下游引物plnD-R 1 μL,rTaq 0.125 μL,ddH2O 16 μL。plnD基因的PCR扩增条件为:预热温度95 ℃,时间5 min;解链温度95 ℃,时间30 s;退火温度53 ℃,时间30 s;延伸温度72 ℃,时间90 s循环30次;温度72 ℃再延伸5 min。扩增结束后取5 μL扩增产物在1%的琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲液中进行电泳,在130 V电压下,跑30 min后,取出胶在EB染色池中染色15 min,然后通过紫外凝胶荧光扫描仪检测。将PCR产物纯化后连接到pMD-19T克隆载体上,转入E.coliDH-5α感受态细胞。在氨苄抗生素的LB平板上涂布培养,挑单菌落PCR鉴定,将获得的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。

图2 嗜酸乳杆菌zrx02系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacillus acidophilus zrx02

1.2.3 生物信息学分析 将测序结果在NCBI网站利用BLAST程序与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比对,并构建系统发育树。利用ORF Finder(Open Reading Frame Finder)对嗜酸乳杆菌zrx02细菌素合成必需基因片段进行阅读框分析,转化成氨基酸序列。对基因编码产物的理化性质进行分析(http://web.expasy.org/protparam),跨膜螺旋信号分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),结构域预测(www.ebi.ac.uk/interPro/search/sequence-search),蛋白质二级结构预测(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopm.html),三级结构建模(https://swissmodel.expasy.org/)。

2 结果与讨论

2.1 16S rRNA鉴定

通过对菌株的16S rRNA基因PCR扩增,得到了1493 bp的基因片段(图1),与GenBank数据库中已知的序列进行比对,利用软件Mega5.1按照Neighbor-Joining法构建系统发育树发现该菌与LactobacillusacidophilusIDCC3302(GenBank登录号KP325412.1)同源性最高,达到99%,推测该菌为嗜酸乳杆菌,命名为Lactobacillusacidophiluszrx02。

图1 嗜酸乳杆菌zrx02的16S基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of 16S gene for Lactobacillus acidophilus zrx02

2.2 嗜酸乳杆菌zrx02基因组DNA及plnD基因克隆

利用细菌基因组抽提试剂盒提取嗜酸乳杆菌zrx02的基因组DNA(图3a),结果显示该菌基因组DNA长度约为19000 bp,以嗜酸乳杆菌zrx02的基因组DNA为模板,利用设计的引物进行PCR扩增,获得plnD基因条带(图3b),测序结果显示长度为355 bp。

图3 嗜酸乳杆菌zrx02的基因组DNA及plnD合成基因的PCR扩增Fig.3 Total genomic DNA of Lactobacillus acidophilus and PCR amplification of gene for plnD

2.3 plnD基因氨基酸序列分析

图4 plnD基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of plnD gene

利用NCBI的ORF Finder工具对嗜酸乳杆菌zrx02的plnD合成基因片段进行阅读框分析,预测编码的氨基酸序列。结果显示该基因序列包含一个全长为279 bp的开放阅读框,起始密码子ATG,终止密码子TAG。预测的氨基酸序列为MLKDQSADL ITQRIIKDINVVQNELKKTNSQRKDVFNYKLGTRYFSL ALDDVILLSTSKLRPGSVQLHAINKVAEFPGNLNALEE KYPQFYS,将氨基酸序列进行BLAST比对分析,采用邻位相接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树(图4)。结果表明从嗜酸乳杆菌zrx02扩增的plnD基因的氨基酸序列与Lactobacillusplantarumstrain(WP 016526896.1)plnD gene的同源性为100%,表明plnD基因的氨基酸序列在同属中具有较高的保守性,亲缘关系较近。

2.4 plnD基因编码产物的理化性质

在线软件蛋白预测结果显示,plnD编码产物共有92个氨基酸,相对分子量10.54 ku,理论等电点9.26,带负电的残基数(Asp+Glu)为10个,带正电荷的残基数(Arg+Lys)为13个,分子式为C474H764N128O141S1,原子数1508,脂肪系数100.65,总平均疏水指数-0.397,不稳定系数25.83%,说明该蛋白较稳定,出现频率较高的氨基酸残基为Leu(13.0%),Lys(9.8%)和Asn(7.6%),不含有Pyl和Sec。预测在N端的序列是Met,哺乳动物网织红细胞(体外)半衰期为30 h,酵母细胞(体内)半衰期为20 h,大肠杆菌细胞(体内)半衰期为10 h。分子量与引物所在文献的报道和其它文献报道的结果有所差异,可能是因为不同物种相关基因存在着分子量差异,并表现出多态性,可利用异源表达来验证该菌所产细菌素的分子量[22-25]。

2.5 plnD基因编码产物氨基酸跨膜螺旋信号分析

跨膜蛋白由跨越脂质膜的片段(通常是螺旋)以及膜外连接这些片断的卷曲区域组成的。跨膜的片段往往含有较高比例的疏水残基,长度常常在20个残基以上,这种相对较长的疏水残基片断在可溶性球蛋白中很少见,因而可以依靠疏水残基片断来进行预测。跨膜螺旋是可以根据序列数据比较准确预测的蛋白质特性之一。plnD基因编码产物氨基酸跨膜螺旋信号分析结果如图5所示,所有氨基酸位于细胞内的概率在20%左右,位于细胞外的概率在80%左右。

图5 plnD基因编码产物的氨基酸跨膜螺旋数据分析结果Fig.5 Results of amino acid transmembrane heices of the encoded product of plnD gene

由在线分析结果可知,plnD基因编码产物氨基酸跨膜螺旋中的氨基酸残基数是0.03689,前60个氨基酸残基数是0.03661,跨膜蛋白判定的相关标准显示,如果预测蛋白前60个氨基酸中跨膜螺旋中有数个氨基酸残基数,预测跨膜螺旋中的氨基酸残基数大于18,则氨基酸很有可能存在跨膜序列,并且蛋白的N端可能存在信号肽[15]。由此可以说明嗜酸乳杆菌zrx02细菌素相关基因plnD编码产物不具有明显的跨膜结构,而且N端不存在信号肽。

2.6 plnD基因编码产物结构域预测

结构域是指在不同的分子中重复出现、有高度相似的序列片段,在线软件分析结果显示plnD基因编码产物没有预测的蛋白家族,但有LytTR DNA-binding 结构域,位于第36～92个氨基酸之间(图6)。

图6 plnD基因编码产物的结构域预测Fig.6 Predict of amino acid domain of the encoded product of plnD gene

2.7 plnD基因编码产物二级结构和三级结构预测

二级结构预测的结果如图7所示。plnD基因编码产物中存在α螺旋、伸展链、β转角和无规则卷曲,其中α螺旋所占比例较高。plnD基因编码产物中有47个氨基酸形成α螺旋,占所有氨基酸的51.09%,16个氨基酸形成伸展链,占所有氨基酸的17.39%,21个氨基酸形成无规则卷曲,占所有氨基酸的22.83%。

图7 plnD基因编码产物的二级结构分析Fig.7 Analysis of secondary structure of the encoded product of plnD gene注:长竖条纹代表α螺旋;中竖条纹代表伸展链; 短竖条纹代表β转角;超短竖条纹代表无规则卷曲。

将氨基酸序列进行同源建模,得到plnD基因编码产物的三级结构图,如图8所示。plnD蛋白模型与Streptococcuspneumoniae中的ComE同源性最高(22.22%)。

图8 plnD基因编码产物的三级结构Fig.8 Tertiary structure of the encoded product of plnD gene

3 结论

本研究利用细菌素plnD基因的特异性引物对嗜酸乳杆菌zrx02基因组DNA进行PCR扩增,发现该菌基因组中存在相关合成基因,通过生物信息学分析plnD基因编码产物,发现该编码产物共有92个氨基酸,相对分子量10.54 ku。依据不稳定系数需小于40才是稳定蛋白的标准,可判断plnD编码蛋白是稳定蛋白,这与软件分析的结果一致,另外嗜酸乳杆菌zrx02细菌素合成相关基因(plnD)编码产物不具有明显的跨膜结构,而且N端不存在信号肽,说明产物可以大量的分泌到胞外,可直接用发酵液做防腐处理。因此,本研究利用基因克隆筛选细菌素的方法有一定的应用价值,不仅为食品防腐提供材料,而且为细菌素合成机制提供了研究基础。

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