自由基氧化对中国对虾肌原纤维蛋白的影响

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(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000)

中国对虾又称东方对虾,属节肢动物门,甲壳纲,十足目,对虾科[1]。其肌肉发达,口感鲜嫩且含有人体所需的多种营养成分,具有“虾类之冠”的美称。中国对虾富含人体所需优质的蛋白,其主要组成部分为肌原纤维蛋白。有研究表明,虾类肌原纤维蛋白的含量高低直接影响其肉质的口感,肌原纤维蛋白含量越高其肉质口感越好。早在1989年,AM Pearson就曾经报道过虾肉中的肌原纤维蛋白可以直接影响对虾的弹性、多汁性以及口感等[2]。可见肌原纤维蛋白对虾类的营养价值、食用品质及功能性起到重要作用。

中国对虾含有较高的水分,且其肌肉组织较为松软,死后容易迅速自溶并且容易发生蛋白质氧化,导致对虾在运输途中容易腐败变质,货架期缩短[3]。马璐凯[4]等人在研究海藻糖、海藻胶及寡糖对南美白对虾蛋白质冷冻变性的抑制作用,防止虾仁肌原纤维蛋白含量的下降作为其研究的主要指标之一。李艳青[5]等人也研究了自由基氧化引起鲤鱼肌原纤维蛋白结构的变化。Han Lu[6]等人研究了凝胶性质是否会受到体内肌原纤维蛋白氧化的影响,并为凝胶的加工提供相关信息和依据。因此自由基氧化中国对虾肌原纤维蛋白可为减缓虾肉蛋白氧化提供理论依据。

本课题通过建立模拟自由基氧化体系,模拟虾肉在贮存情况下受到自由基氧化的环境,通过测定巯基含量,二聚酪氨酸含量和羰基含量变化期望了解自由基氧化对中国对虾肌原纤维蛋白的影响规律,同时利用SDS-PAGE凝胶电泳,分析中国对虾蛋白质,尤其是肌原纤维蛋白受到氧化后的降解情况,为中国对虾长期冻藏及运输,延长货架期,提供一定数据理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中国对虾 于2016年10月购于锦州市林西路海鲜市场,选择鲜活,质量接近(40±10) g的完整中国对虾,购买后立即放置于布满冰块的泡沫箱中,1 h内运至实验室进行实验;Trolox、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 美国Sigma公司;过氧化氢(H2O2) 荆州双雄化工科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 石家庄杰克化工有限公司;三氯乙酸(TCA)、尿素、丁基羟基茴香醚(BHA)等(均为分析纯) 上海沪峥生物科技有限公司;彩虹180广谱蛋白Marker、抗坏血酸钠 北京索莱宝科技有限公司;茶多酚(食品级) 河北银峰食品科技有限公司;三氯化铁 天津大茂化学试剂厂。

HWS-12型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;PHS-25型台式酸度计 上海仪电科学股份有限公司;AUW220D型分析天平 日本岛津公司;D-8PCS型紫外分光光度计 菲勒仪器有限公司;5424R型冷冻高速离心机 Eppendorf艾本德(上海)国际贸易有限公司;STSRH-200型实验室均质机 上海索廷机电设备有限公司;Bio-rad型电泳仪 伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对虾肌原纤维蛋白的提取[5]原料→去头、壳→切碎→加入10倍体积20 mmol/L磷酸盐缓冲液→匀浆(2 min)→离心(8500 r/min,4 ℃,20 min)→取沉淀→洗涤→取沉淀→匀浆(加入pH=7.4磷酸盐缓冲液,4 ℃,1 min)→离心(8500 r/min,4 ℃,20 min)→肌原纤维蛋白。

1.2.2 对虾肌原纤维蛋白的氧化 将提取出的肌原纤维蛋白分为12组,利用自由基氧化体系(10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗坏血酸钠并分别加入0、1、5和10 mmol/L过氧化氢)来模拟氧化。在25 ℃,不同浓度过氧化氢的氧化体系分别反应1、3、5 h。加1 mmol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚终止氧化反应,测定羰基含量、二聚酪氨酸含量、自由疏基含量、表面疏水性指标，并进行SDS-PAGE电脉[7]。

1.2.3 羰基含量的测定 参考Oliver[8]等的方法,并稍作修改。向离心管中加入1 mL样品溶液,浓度为2 g/mL的,每管中加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼,室温下漩涡振荡反应1 h后,加入3 mL 20%三氯乙酸,于10000 r/min离心5 min,取沉淀部分加入1 mL乙酸乙酯∶乙醇(1∶1)混合溶液,沉淀需反复清洗三次,加3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液后,于37 ℃水浴锅中保温20 min,待沉淀溶解后,再将反应液于10000 r/min离心3 min除去不溶物质,所得沉淀在370 nm处测吸光值,使用分子吸光系数22000 M-1·cm-1计算羰基含量,羰基含量表示为nmol/mg蛋白。

1.2.4 二聚酪氨酸含量的测定 参考Davies等[9]描述的方法,稍作调整:取10 mg样品溶解在10 mL pH为6.0的20 mmol/L磷酸盐缓冲液中(含0.6 mol/L氯化钾)。经多次过滤除去溶液中的不溶性物质,通过双缩脲法测定被溶解的蛋白浓度。利用荧光分光光度计测定二聚酪氨酸含量,发射波长为420 nm,激发波长为325 nm,狭缝宽度均为10 nm。最终的二聚酪氨酸含量为所得吸光值除以蛋白浓度,即相对荧光值,单位为(arbitrary units,简写AU)。

1.2.5 自由巯基含量的测定 蛋白质的自由巯基基团含量使用Ellman试剂法进行[10]测定。方法如下:将2.5 mL反应缓冲液(0.10 mol/L磷酸钠,0.001 mol/L乙二胺四乙酸,pH=7.27)和50 μL 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液充分混合后置于15 mL离心管中,分别加入250 μL不同浓度的二硫苏糖醇(DTT)标准溶液和待测样品并充分混合,于25 ℃下孵育15 min。置于波长412 nm处检测光吸收OD值。根据标准样品的OD值和DTT浓度建立标准曲线,从而计算样品中自由巯基的浓度。所得标准曲线方程y=407.14x-4.9954,R2=0.99。然后将样品测得的吸收值代入方程可得样品中含有的自由巯基浓度。

1.2.6 表面疏水性的测定 参考曾茂茂[11]等人的研究方法。采用ANS荧光探针法来测定肌原纤维蛋白的表面疏水性,将经过自由基氧化体系模拟氧化后的肌原纤维蛋白溶解于pH7.0,浓度为0.01 mol/L的磷酸缓冲液中,浓度范围为0.05～10 mg/mL。取2 mL样品溶液,加入20 μL 8 mmol/L ANS,振荡5 min,静置3 min。在激发波长λex=390 nm,发射波长λex=470 nm的条件下测定荧光强度。以荧光强度对蛋白质浓度做曲线,肌原纤维蛋白分子的表面疏水性(So)以曲线初始阶段的斜率表示。

1.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 分别取经不同浓度过氧化氢的自由基氧化体系氧化后的中国对虾肌原纤维蛋白溶液(20%)20 μL,依次上样。本实验分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度4.8%,样品进入分离胶前电流控制在15～20 mA;待样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后,电流升到30～45 mA,电泳过程中保持电流不变。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2 cm处停止,约1～2 h。后采用浓度为0.25%的考马斯亮蓝染液染色1 h,脱色2～4 h。

1.2.8 数据分析 本文数据处理采用SPSS 16.0进行方差分析,差异性显著(p<0.05),Microcal Excel2010等软件进行图表的绘制和相关数据的处理。

2 结果与分析

2.1 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白中羰基含量的影响

蛋白质主肽链断裂形成羰基化合物,与相邻蛋白质分子上的氨基反应形成希夫碱[12]。因此羰基含量的变化可以作为蛋白质氧化程度的一个重要指标[13]。

由图1可以看出看出随着氧化剂浓度的升高，羰基含量呈上升趋势，并随着时间的延长不同浓度过氧化氢组之间的羰基含量变化更加明显。其中过氧化氢浓度为10 mmol/L组,羰基含量从40.25 nmol·mg-1增加到85.30 nmol·mg-1。与Lin Chen[7]等人对于正常猪肉与变质猪肉在氧化条件下羰基变化的研究相符。将相同氧化时间,不同过氧化氢浓度处理过的肌原纤维蛋白中羰基含量进行两两对比,发现未添加过氧化氢组与过氧化氢组相比都有显著差异(p<0.05)。分析原因可能是过氧化氢中的·OH使氨基酸侧链上NH-或NH2-转化为羰基基团[12]。

图1 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白羰基含量的影响Fig.1 Effects of free radical generating system on carbonyl contents of Chinese Penaeus myofibrillar protein注:字母不同表示同一氧化时间，不同浓度间差异显著 (p<0.05);图2～图4同。

2.2 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白中二聚酪氨酸含量的影响

酪氨酸在活性氧存在时会发生氧化反应[15],且蛋白质氧化后,氨基酸残基侧链与邻近的活性氨基酸残基会发生共价交联反应,两个酪氨酸残基通过络合作用而生成二聚酪氨酸[16]。

由图2可以看出在相同氧化时间下,随氧化剂浓度的增加,二聚酪氨酸含量也会增加。在氧化时间从1 h延长到3 h时,相同浓度氧化剂氧化后的蛋白中二聚酪氨酸含量呈上升趋势。当氧化时间从3 d增长到5 h时,过氧化氢浓度为10 mmol/L组中二聚酪氨酸含量从688 AU上升到697 AU,但是增加幅度远低于1～3 h时的增加幅度。且5 h组二聚酪氨酸含量与3 h组二聚酪氨酸含量相比较无显著差异(p>0.05)。可能由于二聚酪氨酸分子内发生重排[17]。随着氧化剂浓度的增加以及氧化时间的延长二聚酪氨酸的含量还是成增加趋势,与李艳青[18]等人研究的自由基氧化体系对于鲤鱼肌原纤维蛋白二聚酪氨酸含量的影响相一致。

图2 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白二聚酪氨酸含量的影响Fig.2 Effects of radical generating system on dityrosine contents of Chinese Penaeus myofibrillar peotein

2.3 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白中自由巯基含量的影响

肌原纤维蛋白氧化后,空间结构遭到破坏并使巯基暴露出来,被自由基进攻后从而生成二硫键,因此蛋白中的自由巯基含量的减少可以作为蛋白氧化的一个重要指标[5]。

由图3可知,中国对虾肌原纤维蛋白的自由巯基含量可以随着氧化时间延长和氧化剂浓度的增高而呈显著的降低趋势,且相同氧化时间下未添加过氧化氢组、过氧化氢浓度为1、5、10 mmol/L组两两相比较，均有显著差异(p<0.05)。Dean[17]等人在蛋白质氧化的研究中指出,自由基在氧化蛋白质的过程中使巯基转换成二硫键这一初期反应产物。多肽分子之间的或多肽内部的二硫键形成可能是导致巯基含量降低的主要原因。也可能是进一步氧化成磺酸类或其他氧化产物,才导致巯基含量的下降。

图3 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白自由巯基含量的影响Fig.3 Effects of free radical generating system on sulfhydryl groups contents of Chinese Penaeus myofibrillar protein

2.4 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

蛋白质结构稳定性最主要依靠疏水作用,疏水作用在维持蛋白质结构稳定与功能表达上起着十分重要的作用。由于蛋白质具备大分子结构,因此表面疏水性比整体的总疏水性对蛋白质的功能特性产生更大的影响[20]。由于蛋白质氧化可以使其中的疏水性氨基酸暴露或者包埋[21]。因此中国对虾肌原纤维蛋白表面疏水性可以反映蛋白质经氧化后其结构稳定性的变化。由图4可知,随着过氧化氢浓度的增加以及氧化时间的延长,中国对虾肌原纤维蛋白表面的疏水性均呈上升趋势。在3 h的氧化时间下,随过氧化氢浓度的提高,其表面疏水性分别上升63.3%、75.9%和82.1%。在相同氧化时间下，未添加过氧化氢组、过氧化氢浓度为1、5、10 mmol/L组两两比较均有显著性差异(p<0.05)。

图4 自由基氧化体系对中国对虾肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig.4 Effects of free radical generating system on the surface hydrophobicty of Chinese Penaeus myofibrillar protein

2.5 SDS-PAGE

图5 自由基氧化体系中3 h氧化中国对虾肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图谱Fig.5 SDS-PAGE pattern of Chinese Penaeus myofibrillar protein subjected to hydroxyl radical oxidation for 3 h注:1为Maker;2～5为过氧化氢浓度分别为0、1、5、10 mmol/L。

SDS-PAGE凝胶电泳可以反映蛋白质经氧化后,不同分子量蛋白的降解情况[22]。肌原纤维蛋白是组成肌肉中肌原纤维的蛋白质,其中肌球蛋白占蛋白质总量的54%,肌动蛋白占蛋白质总量的20%～25%,还有原肌球蛋白、肌原蛋白和少量功能不明的调节性结构蛋白质。由图5可知,蛋白质在经过3 h,不同浓度的氧化剂氧化后发生了一定的变化。在相同氧化时间,随着过氧化氢浓度的升高,均生成了17 kDa的小分子量蛋白质条带，说明每条泳道上肌原纤维蛋白均发生了一定的水解。在自然条件下，虾肉中的肌原纤维蛋白在活性氧的作用下也会发生轻微的水解[17]，通过对比条带颜色可以发现过氧化氢浓度1 mmol/L组、5 mmol/L组和10 mmol/L组的蛋白质的水解情况要高于未添加过氧化氢组[23]，且随着过氧化氢浓度的升高，17 kDa的小分子量蛋白质条带颜色越深，说明水解程度越明显。说明氧化剂浓度改变可以对虾肉中肌原纤维蛋白降解产生不同影响。

3 结论

中国对虾肌原纤维蛋白经自由基氧化体系氧化后,羰基含量、肌原纤维蛋白的表面疏水性及二聚酪氨酸含量显著升高(p<0.05)，而自由巯基含量显著降低(p<0.05)。通过SDS-PAGE电泳可以观察出,经自由基氧化的虾肉肌原纤维蛋白明显发生了降解,且随氧化剂浓度的增加，会促进肌原纤维蛋白的水解。所以抑制虾肉蛋白质的氧化是虾肉制品在加工、贮藏和运输的关键点,在运输过程中,可以减少虾肉与氧气的接触,例如真空包装可以延长其货架期并尽可能保留虾肉的原有营养价值。

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