脱氧雪腐镰刀菌烯醇的环七肽模拟表位筛选

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(暨南大学生命科学技术学院生物工程学系,广东广州 510632)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)又名呕吐毒素,是污染粮食和动物饲料的最为广泛的天然毒素之一。DON性质稳定,具有较强的热抵抗力和耐酸性[1],因此一般的食品加工不能破坏其结构。人和动物摄入DON通常会产生多种中毒症状,如肠道粘膜刺激或坏死、腹泻、呕吐及食欲下降、增重下降和免疫功能改变等[2-3]。此外,DON还具有很强的细胞毒性和胚胎毒性,是一种潜在的致癌物[4-5]。因此,中国、欧盟等多国均规定了DON在粮食、饲料中的限量标准[6]。

目前,运用免疫学技术(ELISA、胶体金试纸条)检测霉菌毒素污染的试剂盒已商品化[7]。但是这些霉菌毒素免疫学测定法要使用到毒素标准品,带来的劣势有毒素小分子提取困难;我国使用的产品大部分依赖于进口,相对成本增加[8];毒素分子容易污染环境和对人体有害,因此许多科研机构近几年来都在研制毒素标准品的替代品,如应用抗独特型抗体模拟皮质醇,黄曲霉毒素等[9-10];用噬菌体库筛选多肽模拟GTX2,3[11]。本研究拟通过噬菌体肽库筛选技术获得可模拟DON的模拟肽,可以作为DON毒素标准品的替代物,为建立安全、灵敏的绿色环保型免疫学检测体系奠定基础。

噬菌体展示技术能够高效地筛选出具有特异性的功能性多肽[12-13]，不仅能够研究受体和配体之间的结合位点、以受体为靶分子寻找高亲和力的配体,而且还能用于疫苗和诊断试剂盒以及新型抗肿瘤药物的研制等领域[14-16]。邓舜洲等[17]通过噬菌体随机七肽库中淘选出脱氧雪腐镰刀菌烯醇的两个模似表位的单克隆噬菌体,但是这两株噬菌体建立的竞争曲线的灵敏度不够高,因此需要进一步的筛选更好的模拟表位来替代标准毒素DON。本研究拟通过噬菌体随机肽库继续淘选出灵敏度更高的模拟表位,为建立DON的无毒检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

E.coliER2738宿主菌、环七肽库试剂盒、测序引物 New England Biolabs公司;琼脂粉 Sigma公司;四环素、PEG8000 北京鼎国公司;Tris和L-Glycin 鼎国公司;Xgal Fermentas公司;蛋白胨、酵母粉 OXOID公司;IPTG USB公司;DON单克隆抗体 珠海市英平生物科技有限公司;OVA Sigma公司;NaCl 广州化学试剂厂。

恒温水浴箱、恒温培养箱 上海精宏实验设备公司;净化工作台 苏州净化设备厂;Multiskan MK3自动酶标分析仪Thermo Labsystem公司;台式高速冷冻离心机 Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 噬菌体肽库的筛选 用缓冲液稀释DON单抗至100 μg/mL,100 μL/孔包被至酶标板里,4 ℃过夜。加2.5% OVA封阻缓冲液,200 μL/孔,37 ℃封闭2 h。用稀释至1×1011pfu/mL的Ph.D.-C7C肽库加入板孔,100 μL/孔,37 ℃结合2 h。Glycin-HCl缓冲液洗脱,用1 mol/L Tris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。总共进行四轮筛选,在每轮筛选后都进行滴度测定。每轮筛选中,将投入噬菌体的量定为产入量,洗脱得到的噬菌体量(噬菌体滴度)定为产出量(pfu),分析四轮回收率的情况。回收率计算公式:回收率=产出量/产入量。

1.2.2 噬菌体滴度测定 取噬菌体的洗脱物,用LB培养基作10倍系列稀释。每管加入3 mL上层琼脂,50 ℃水浴保温。取10μL稀释梯度为10-7、10-8、10-9、10-10的噬菌体,加入200 μL培养至对数中期(OD600=0.5)的ER2738,倒进预热的LB-IPTG/Xgal平板,37 ℃培养过夜。计数的平板上不能超过100个蓝斑。噬菌体滴度(pfu/10 μL)=平板上的蓝斑数×稀释倍数。

1.2.3 扩增和纯化 挑取噬菌体克隆到培养液中,37 ℃振荡培养4.5～5 h。4 ℃、10000 r/min离心10 min,上清液即为扩增的噬菌体液。每瓶ER2738培养液中接种扩增的噬菌体液,37 ℃振荡培养4.5～5 h。再离心两次,取上清液,加25%体积的PEG/NaCl(PEG8000 20 g,NaCl 14.625 g,三蒸水定容至100 mL，高压灭菌,室温保存),4 ℃过夜。4 ℃、12000 r/min离心20 min,弃上清,沉淀用PBS重悬,再次离心5 min,取上清液,加25%体积的PEG/NaCl,4 ℃静置2 h,再离心两次,弃上清,用PBS重悬,4 ℃、l0000 r/min离心1 min,取上清贮存。

1.2.4 噬菌体阳性克隆结合活性分析 间接ELISA测定噬菌体单克隆与DON单抗结合活性。随机挑取1.2.2中得到的单克隆蓝斑,将稀释至100 ng/mL的DON单抗包被在酶标板,100 μL/孔,4 ℃过夜。PBS为空白对照。200 μL/孔2.5% OVA封阻缓冲液37 ℃封闭2 h。加入噬菌体单克隆100 μL,37 ℃结合1 h。加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(1∶5000稀释)100 μL,37 ℃结合1 h。TMB法显色,酶标仪检测各孔A450。间接竞争ELISA测定噬菌体展示肽与DON毒素是否具有相似的抗原表位,操作流程类似间接竞争ELISA,不同处为同时加入50 μL、100 ng/mL的DON标准品和50 μL噬菌体单克隆。只加100 μL噬菌体单克隆菌液作为无竞争物的阴性对照。

1.2.5 PCR扩增目的基因 根据噬菌体阳性克隆的编码DNA序列,设计的两段引物序列为:5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′;5′-CGCAATTCC TTTAGTGGTACCTTTC-3′;由华大基因公司合成。PCR反应条件:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环,最后72 ℃延伸5 min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并进行DNA测序(由华大基因公司测序)。

1.2.6 模拟表位的理化性质分析 噬菌体环七肽的结构为AC(*)7CGGG,其中*为插入的外源肽。ProtParam软件来分析其理化性质。

1.2.7 阳性噬菌体竞争抑制曲线的建立 稀释至100 ng/mL的DON单抗包被在酶标板中,100 μL/孔,4 ℃过夜。加2.5% OVA封阻缓冲液200 μL/孔,37 ℃封闭2 h。分别加入50 μL不同浓度梯度的DON标准品(500、250、100、50、25、12.5 ng/mL)和50 μL阳性噬菌体单克隆,37 ℃结合1 h。PBS为空白对照。加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(1∶5000稀释)100 μL,37 ℃结合1 h。TMB法显色,酶标仪检测各孔A450,做出曲线。

1.2.8 与其他抗体交叉反应 用100 ng/mL DON单抗加入酶标板包被100 μL/孔,同样的方法包被ZEN单抗1G4和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)单抗的抗独特型单抗Ab2β-1D5,4 ℃、16 h。以不包被的板孔作为阴性对照,PBS为空白对照。加2.5% OVA封阻缓冲液37 ℃封闭2 h。加噬菌体单克隆100 μL,37 ℃孵育1 h。加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体(1∶5000稀释)100 μL,37 ℃结合1 h。TMB法显色,检测各孔A450。

1.3 数据处理

数据处理采用统计学的方法，所用到的软件有GraphPad Prism 5、Bioedit、ProtParam软件。

2 结果与分析

2.1 噬菌体肽库筛选结果

亲和筛选富集效果以回收率为指标。筛选结果见表1,回收率随着筛选次数的增加而升高,表明了能够与DON高亲和力结合的噬菌体得到了富集。

表1 噬菌体的富集Table 1 Enrichment of phages

2.2 阳性噬菌体与抗原结合分析

图1 噬菌体克隆与DON竞争结合DON单抗Fig.1 Phage clones compete with DON for binding to DON mAbs注:A:1～10号噬菌体克隆与抗原结合分析; B:11～20号噬菌体克隆与抗原结合分析; C:21～30号噬菌体克隆与抗原结合分析。

随机挑取30个噬菌体单菌落,顺次编号为1～30。图1显示1～30号噬菌体单克隆和DON毒素竞争结合DON单抗能力。本实验共挑取30个单克隆,酶标仪在450 nm吸光度时检测的吸光值为OD450。当测试样品OD450(S)与阴性对照OD450(N)的比值(S/N)≥2∶1时判断为阳性克隆。如图1所示,其中24号和27号克隆的OD450值与阴性对照OD450值很接近,因此它们为阴性噬菌体,剩余的都为阳性噬菌体;对阳性菌落继续进行竞争ELISA鉴定发现12、28、29和30号克隆不能明显地被DON标准品阻断,其余的可以被DON标准品阻断。因此取1～11、13～23、25、26号单克隆噬菌体继续进行下一步的实验。

2.3 阳性噬菌体克隆DNA的PCR结果

图2为阳性噬菌体PCR产物测序结果,结果显示噬菌体克隆1～10、13～23、25、26号在约200 bp处出现单一目标条带,因此它们为阳性克隆。阳性克隆DNA的测序结果为:只有4号噬菌体的DNA序列为TPWTQHL，其余噬菌体的DNA序列为PFPNHPY。在序列为PFPNHPY的噬菌体中随机挑选8号菌进行下一步实验。

图2 阳性克隆目的片段的PCR产物Fig.2 PCR products of the positive clones’s target fragment注:从左到右泳道分别为阴性对照、Marker、 阳性克隆1～10、13～21、23、25、26。

2.4 模拟表位的理化性质分析

用ProtParam软件分析ACPFPNHPYCGGG序列,分子量是1319.4;平均亲水性指数是-0.338(软件说明：亲水性指数<0为亲水),为亲水性;序列ACTPWTQHLCGGG分子量是1330.5;平均亲水性是-0.092,为亲水性;两个表位的PI值均是6.76,半衰期相同,不稳定指数(II)均大于40。结果显示两种模拟表位均具有亲水性、理论等电点在6.76等物化特征。但是由于两个表位的氨基酸序列不稳定,因此后期实验需要提高其稳定性。

2.5 噬菌体克隆与DON竞争抑制曲线的建立

因为只有4号噬菌体的DNA序列为TPWTQHL，其余噬菌体的DNA序列为PFPNHPY。在序列为PFPNHPY的噬菌体中随机挑选8号菌与序列为TPWTQHL的4号菌进行下一步实验,建立与DON毒素标准品的竞争抑制曲线,见图3。图3A为8号噬菌体与DON标准品建立的竞争抑制曲线,检测线性范围为0.0292～0.636 μg/mL,IC50为0.169 μg/mL,回归方程为:y=-52.32x+166.69(其中x是标准品DON的浓度,y是抑制率),R2=0.987。图3B为4号噬菌体与DON标准品建立的竞争抑制曲线,检测线性范围为0.0124～0.271 μg/mL,IC50为58 ng/mL,回归方程为:y=-44.80x+129,R2=0.983。从图3中可知2株噬菌体克隆均能与DON毒素竞争结合DON单抗,随着标准品DON浓度的增加,抑制率降低,结果表明这两株噬菌体克隆展示的环七肽与DON存在相似的抗原表位,可以作为DON的替代物,用于后续建立检测DON毒素污染的免疫学方法研究。

图3 8号(A)和4号(B)噬菌体的竞争抑制曲线Fig.3 Competitive inhibition curve of NO.8 phageand NO.4 phage

2.6 阳性噬菌体与其他抗体交叉反应

如图4所示,两种噬菌体单克隆与DON单抗结合的能力远远大于与另两种抗体结合能力,由此可知这两种噬菌体能够特异性地结合DON单抗。

图4 噬菌体与其他抗体的交叉反应Fig.4 The cross-reactivity between phage and other antibodies注:4代表4号噬菌体,8代表8号噬菌体,空白代表只加入PBS的空白对照。

3 结论与讨论

本实验以DON单克隆抗体为配体,在噬菌体环七肽库中淘选DON的模拟表位,筛选出两种不同氨基酸序列的阳性噬菌体克隆,它与DON毒素标准品对DON单抗的结合存在良好的竞争抑制关系,初步认为其可以代替DON毒素标准品,为建立DON无毒免疫学检测技术奠定基础。

与Yuan[18]等在噬菌体展示七肽库里筛选出的两条可以模拟DON表位的多肽SWGPFPF、SWGPLPF比较,用SWGPFPF序列合成的短肽建立的竞争抑制曲线的IC50为0.64～0.8 μmol/L,即0.19～0.237 μg/mL。而本实验得到的PFPNHPY和TPWTQHL两种噬菌体单克隆与DON竞争抑制曲线的IC50分别为0.169、0.058 μg/mL。对比可知本研究获得DON模拟肽结构可能与DON的抗原表位更接近,需要后续合成两种模拟肽进一步深入研究。

两种DON模拟表位理化性质分析结果显示均为不稳定,在后期实验中当pH、温度、状态等条件发生改变时,容易发生变性,因此后期提高两段表位稳定性是十分必要的。综上所述,本研究通过噬菌体环七肽库筛选出两个DON的模拟表位,并成功建立起其与DON标准品竞争抑制曲线,为建立起环保型DON免疫学检测奠定了基础,同时也表明了噬菌体库筛选方法具有良好的应用前景。

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