主成分分析和聚类分析法研究刺玫果黄酮类成分HPLC指纹图谱

,,,,

(山西省医药与生命科学研究院,山西太原 030006)

表1 刺玫果样品信息Table 1 Sample informations of Rosa davurica

刺玫果为蔷薇科蔷薇属植物刺玫的成熟果实,又名蔷薇果、刺莓果,分山刺玫(RosadavuricaPall.)和黄刺玫(RosaxanthinaLindl.)两种,广泛分布于山西、河北、东北和内蒙古等[1]。山西省以黄刺玫为主,主要分布在吕梁山脉、太行山脉、五台山、中条山等山区,资源丰富、产量高,是一种经济价值高、食药同源的野生果类,民间大量采食用于泡茶、泡酒等[2]。《中药大辞典》记载其有健脾理气、养血调经的作用[3]。现代研究发现,刺玫果含有丰富的维生素、氨基酸、黄酮、皂苷和植物超氧化物歧化酶(SOD)等活性成分[4],具有预防心血管病变和抗衰老的作用,其中黄酮类物质对高血脂和抗氧化疗效显著。目前,以野生刺玫果为主要原料的食品、保健品和功能性饮料日益受到重视并广泛开发[5]。

近年来指纹图谱技术得到了广泛应用,但是仅以相似度并不能对中药质量做出较全面的评价。化学模式识别技术是根据物质所含化学成分的信息,利用计算机对其进行分类或描述的方法,能够较好的满足复杂化学成分信息的模糊性和整体性的要求[6-7]。目前化学模式识别技术已广泛应用于食品和药品的分类和质量评价,尤其以主成分分析和聚类分析居多,如马赟[8]等人应用聚类分析和主成分分析对甜味绞股蓝黄酮类成分进行研究,结果发现其成分差异与产地生态环境、采集加工方法等因素有关;Dongnan Li[9]等人采用液相色谱-质谱法结合主成分分析对蓝莓中花色苷成分进行研究,结果发现地域差异是影响蓝莓中花色苷成分的主要因素。目前虽有文献对刺玫果指纹图谱进行了探讨[10-11],但仅以相似度为评价指标,并未对其品种进行分类,也未对共有特征峰进行统计学分析,信息量非常有限。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立了以刺玫果黄酮类成分为基础的指纹图谱,考察了30批不同产地、不同品种刺玫果的相似度,并基于指纹图谱信息综合运用主成分分析(Principal component analysis,PCA)和系统聚类分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)进行化学模式识别研究,为刺玫果的品种鉴别和质量评价提供较全面的评价方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺玫果样品 共30批样品信息见表1(其中S1和S13为人工栽培,其余均为野生),样品经山西省医药与生命科学研究院王晓燕高级工程师分别鉴定为蔷薇科植物:黄刺玫(RosaxanthinaLindl.)和山刺玫(RosadavuricaPall.);芦丁对照品 中国食品药品检定研究院,批号100080-201409;金丝桃苷对照品 中国食品药品检定研究院,批号:111521-201004;槲皮素对照品 成都普思生物科技股份有限公司,批号PS0605-0025;乙腈 色谱纯,西陇化工有限公司;磷酸、95%乙醇 分析纯，天津登丰化学品公司;超纯水自制。

Agilent 1200型高效液相色谱仪(配DAD检测器) 美国安捷伦科技公司;AB104.N 型分析天平 上海托利-梅特勒仪器有限公司;UPHW-I-90T型优普系列超纯水系统 成都超纯科技有限公司;XA-1型多功能粉碎机 山东省青州市益康中药机械有限公司;MH-500电子调温电热套 北京科伟仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品芦丁2.0 mg、金丝桃苷2.0 mg和槲皮素1.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,配成浓度分别为0.2、0.2和0.1 g/L的混合对照品贮备液,经0.22 μm微孔滤膜过滤后,进HPLC分析。

1.2.2 供试品溶液的制备 取适量刺玫果适当粉碎,精密称取粗粉10.0 g,置于圆底烧瓶中,加入70%的乙醇溶液100 mL,回流提取1 h,过滤,取续滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤,作为供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 安谱Athena-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:360 nm;进样量:20 μL。流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱程序:0～10 min,12%～16% A;10～26 min,16%～16% A;26～44 min,16%～28% A;44～53 min,28%～30% A;53～58 min,30%～35% A;58～60 min,35%～12% A。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度实验 取刺玫果粗粉10.0 g,按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,连续进样6次,按“1.2.3”项下色谱条件进行测定,记录指纹图谱,计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值。

1.2.4.2 重复性实验 称取同一批刺玫果粗粉6份,每份10.0 g,按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项下色谱条件进行测定,记录指纹图谱,计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值。

1.2.4.3 稳定性实验 取同一供试品溶液分别于制备后 0、4、8、12、18、24 h,按“1.2.3”项下色谱条件进行测定,记录指纹图谱,计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值。

1.2.4.4 加样回收率实验 取已知芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量的刺玫果粗粉6份,每份10.0 g,置于圆底烧瓶中,加入70%的乙醇溶液99 mL,同时加入混合对照品溶液1 mL(相当于提取液中含芦丁2.0 mg/L、金丝桃苷2.0 mg/L和槲皮素1.0 mg/L),按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项下色谱条件进行测定,计算芦丁、金丝桃苷和槲皮素的加样回收率。

1.3 数据分析

采用SPSS 22.0 软件以不同品种产地刺玫果共有峰的峰面积为初始数据,经标准化处理后以主成分的方差贡献率和特征值为依据,进行主成分分析;采用SPSS 22.0 软件对共有峰数据进行标准化处理,采用组间连接法、欧氏距离平方作为样品测度,对不同品种产地的刺玫果的共有峰进行系统聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件考察

实验初期考察了不同的流动相系统,包括甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%乙酸和乙腈-0.2%甲酸。有报道[12]采用甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.5%醋酸系统,由于四氢呋喃会对仪器管路造成一定的腐蚀,因此没有考虑此系统。结果表明乙腈-0.1%磷酸系统的各色谱峰分离情况和峰形均较好。根据3D全波长扫描图谱,选择性考察了210、254、270 和360 nm波长下的色谱图,结果表明波长为360 nm时基线较稳,色谱峰较多且分离效果良好,因此选择360 nm为检测波长。

2.2 方法学考察

精密度实验结果相似度大于0.99,各共有峰的相对保留时间RSD小于0.9%,相对峰面积RSD小于2.9%;重复性实验结果相似度大于0.99,各共有峰的相对保留时间RSD小于1.0%,相对峰面积RSD小于4.1%;稳定性实验结果相似度大于0.99,各共有峰的相对保留时间RSD小于1.0%,相对峰面积RSD小于4.9%;加样回收率实验结果显示,芦丁、金丝桃苷和槲皮素的加样回收率分别为97.3%±1.2%,96.2%±1.9%和98.2%±1.1%,RSD分别为3.2%、2.4%和2.6%。结果表明仪器精密度良好,方法重复性、准确度良好,供试品溶液在室温下24 h 内稳定性良好,符合指纹图谱的要求。

2.3 指纹图谱的构建

分别取30批刺玫果样品,按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,另取混合对照品溶液20 μL,按“1.2.3”项下色谱条件进行测定,记录样品和对照品的色谱图。样品谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》软件,剪切前5 min溶剂峰后,采用多点校正进行数据匹配,选用均值法生成刺玫果共有模式的对照指纹图谱(R),结果见图1、图2。由于刺玫果中大部分化学成分尚且未知且实验条件有限,未能对其共有峰进行定性研究,通过与已有标准品对照得知,图2中5号峰为芦丁,7号峰为金丝桃苷,13号峰为槲皮素。

表2 30批刺玫果中芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量测定结果(μg/g)Table 2 Determination results of rutin,hyperoside and quercetin in 30 batches of Rosa davurica(μg/g)

图1 混合对照品的色谱图Fig.1 The chromatogram of hybrid reference substance注:1.芦丁;2.金丝桃苷;3.槲皮素。

图2 刺玫果样品的对照图谱Fig.2 The reference fingerprint chromatogram of Rosa davurica samples

2.4 含量测定结果

刺玫果中黄酮类成分芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量测定结果见表2。由结果可见,刺玫果中芦丁的含量参差不齐,较高值在60.56～69.51 μg/g之间,包括S1、S19和S22,这3批样品分别来自山西省的太原市、临汾市和吕梁市,其中芦丁含量最高的样品为冷冻鲜果;山刺玫果中金丝桃苷的含量远高于黄刺玫果,是黄刺玫果的几十倍甚至上百倍,而槲皮素的含量也普遍高于黄刺玫果,这2种成分含量最高的样品来自黑龙江加格达奇。由此可见,黄刺玫果与山刺玫果的黄酮类成分在含量上存在一定的差异。

表3 刺玫果样品的相似度评价结果Table 3 Similarity evaluation results of rose fruits

2.5 指纹图谱相似度评价

中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析得到30批刺玫果样品的相似度结果,并确定了15个共有峰。图3为30批样品匹配后的色谱图,相似度计算结果见表3。根据相似度结果可将30批刺玫果大致分为2类:第1类相似度在0.95～1.00之间,包括S1～S22,均为黄刺玫果,此类样品的产地主要为山西省、河北省和陕西省;第2类相似度在0.77～0.94之间,包括S23～S30,该样品均为山刺玫果,产地分别为黑龙江省、吉林省、辽宁省和内蒙古地区。由上述结果可见,不同品种刺玫果之间化学成分存在较大的差异,而不同产地和不同年份之间差异较小。

图3 30批刺玫果样品匹配后的色谱图Fig.3 The matched chromatogram of 30 batches of Rosa davurica samples

表4 共有峰的相对峰面积Table 4 Relative peak areas of common peaks

2.6 主成分分析

主成分分析(PCA)是在尽可能保留原有信息的基础上,将高维数空间的信息映射到低维数的几个主成分上,使数据简化,降低维数,以揭示数据的结构特征。该法具有信息损失量小、相关性优等特点[13-14]。在所得指纹图谱中,6号峰为所有样品共有,分离度较好、峰位相对居中而且峰面积较大,所以确定6号峰为参比峰。以各共有峰对6号峰的峰面积之比为相对峰面积,得到30批样品的15个色谱峰的标准化数据(见表4),采用SPSS 22.0统计软件进行主成分分析。

主成分个数的提取原则是取主成分对应的特征值大于1的2个主成分,其累计方差贡献率为80.3%(见表5),表明该2个主成分能够代表15个指标在30批样品中80.3%的信息。旋转后的因子载荷矩阵见表6,由此可知每个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数[15]。以2个主成分的得分向量建立坐标系得到主成分的得分图(见图4),由图4可见30批样品大致被分为两大类,即黄刺玫果和山刺玫果。结果显示黄刺玫果多聚集在PC1坐标的负值区域,而山刺玫果多聚集在PC1坐标的正值区域和PC2坐标的中心区域,分类结果与相似度结果较一致,表明通过15个特征峰的相对峰面积可识别黄刺玫果和山刺玫果。

直观分析这两类样品色谱峰的相对峰面积发现,山刺玫果的7、12、13、14和15号共有峰的相对峰面积明显大于黄刺玫,而黄刺玫果中的主要峰2、4、6、8和9号峰的峰面积明显大于山刺玫,初步猜测这可能是造成这两种样品分类的主要原因。

表5 主成分方差分析Table 5 Analysis of variance for PCA

表6 旋转后的因子载荷矩阵Table 6 Rotated component matrixa

图4 主成分得分图Fig.4 PCA scores plot

2.7 聚类分析

聚类分析法(HCA)是以“物以类聚”为基本原则来研究事物分类的一种多元统计分析的方法[16]。在判别中药质量的过程中,经常和PCA联合应用,即先通过PCA排除化学数据中微量和无效的干扰信息,再通过HCA进行分类和质量评估[17]。本研究采用 SPSS 22.0 统计分析软件,以系统聚类法中的组间连接法、欧氏距离平方作为样品测度,对30批刺玫果进行聚类分析,并绘制树状图(见图5)。结果显示,当阈值T=25时,30批样品被划分为2类,其中S23～S30自成一类,即山刺玫组,其他22批黄刺玫被分为一类;随着阈值的减小,22批黄刺玫继续被划分为2类,其中S2～S12和S15一类,其余10批样品一类。分类结果与PCA的结果基本一致。

直观分析被分为两类的黄刺玫果的相对峰面积发现,S2～S12和S15的色谱图中2、4、8和9号共有峰的相对峰面积明显小于其他样品,而S2～S12均为晒干样品,猜测可能是这4种化学组分性质不稳定,在晒干过程中受热而发生了降解致峰面积变小,因此黄刺玫果因不同干燥方法被分为两类,即阴干组和晒干组。而阴干组与S1冷冻鲜果的组分比较接近而被分为了一类,可见在阴干的过程中样品中的化学成分相对比较稳定。S15虽然也是阴干,但可能是因为储存时间较长(2013年采集),样品中不稳定成分发生了降解而被分到了晒干组。由此可见,相同种类、不同产地样品之间化学成分差异并不明显,而不同干燥方法和储存时间对样品的影响较大。

图5 系统聚类树状图Fig.5 Dendrogram for the systematic clustering

3 结论

本研究以高效液相色谱指纹图谱数据为基础,结合化学模式识别技术,综合运用相似度评价、主成分分析和聚类分析对30批不同品种、产地和干燥方法的刺玫果样品进行了研究。从化学成分上揭示了不同品种和不同干燥方法的刺玫果之间的差异,并客观地反映了刺玫果内在质量。结果30批刺玫果可根据品种不同快速被分为两大类,然后黄刺玫又进一步被分为阴干和晒干两类。结果表明3种分析方法的结果基本一致,验证了化学模式识别用于品种鉴定和归类的可行性。该方法不仅可以用于刺玫果的品种鉴别和质量评价,还可为下一步制定刺玫果的质量标准提供参考。

通过研究发现,相同品种、不同产地的刺玫果化学成分较为一致,且人工栽培与野生黄刺玫果的品质无显著差异,这说明刺玫果具有较好的产地适应性。而聚类分析结果可看出刺玫果可进一步细分,表明不同干燥方法及储存时间的刺玫果内在化学成分及含量差异较大。天然产物化学成分普遍比较复杂,其对照品大多较难获得[18],本研究采用化学模式识别的方法,无需对照品指认色谱峰,为刺玫果的品种鉴定及质量评价提供了参考。而刺玫果的药理作用和化学成分的差异及相关性有待今后进一步深入研究。

[1]朱琳,曾晓丹,张福胜. 刺玫果中微量元素的测定[J]. 光谱实验室,2013,30(4):1656-1659.

[2]田建华,王巨成. 超临界CO2萃取野生黄刺玫果籽油实验[J]. 山西林业科技,2015,44(4):32-34.

[3]江苏新医学院. 中药大辞典:上册[M].上海:上海科学技术出版社,1985.

[4]陈立波,王建刚.黄刺玫果挥发性成分的SPME-GC/MS分析[J].吉林化工学院学报,2016,33(5):11-13.

[5]王晓林.高效液相色谱法测定刺玫果中槲皮素的含量[J].食品工业科技,2011,32(4):370-372.

[6]刘江,陈兴福,邹元锋.基于中药指纹图谱多维信息的化学模式识别研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(8):1081-1088.

[7]Aryani Sabir,Mohamad Rafi,Latifah K.Darusman. Discrimination of red and white rice bran from Indonesia using HPLC fingerprint analysis combined with chemometrics[J].Food Chemistry,2017,221(15):1717-1722.

[8]马赟,王起文,蔡静,等.聚类分析和主成分分析法研究甜味绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱[J].食品工业科技,2017,38(8):63-67.

[9]Li Dongnan,Meng Xianjun,Li Bin.Profiling of anthocyanins from blueberries produced in China using HPLC-DAD-MS and exploratory analysis by principal component analysis[J].Journal of Food Composition and Analysis,2016,47(6):1-7.

[10]崔凤侠,王领弟,杜义龙.刺玫果提取物指纹图谱构建及4种成分含量测定[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(7):93-96.

[11]杨扬.刺玫果提取物质量及其指纹图谱的研究[D].长春:吉林大学,2015.

[12]王光函,张振秋,张颖,等.HPLC法测定刺玫果中芦丁和金丝桃苷的含量[J].辽宁中医药大学学报,2016,12(6):248-249.

[13]刘欢,何忠俊,梁社往,等.不同产地滇重楼HPLC指纹图谱及化学模式识别研究[J].云南农业大学学报,2013,28(1):88-95.

[14]刘莎莎,张宝善,孙肖园,等.红枣香味物质的主成分分析[J].食品工业科技,2015,36(20):72-76.

[15]黄娇.指纹图谱和主成分分析法评价不同海拔高度的桔梗药材质量[J].食品工业科技,2015,36(13):309-313.

[16]Gu F,Hall P,Miles N J.Performance evaluation for composites based on recycled polypropylene using principal component analysis and cluster analysis[J].Journal of Cleaner Production,2016,41(115):343-353.

[17]王露露,孙倩怡,杨慧海.模式识别及其在中药质量评价中的应用[J].中草药,2016,47(23):4282-4288.

[18]王洋,申丽,江坤,等.中药砂仁质量的化学模式识别研究[J].药物分析杂志,2016,36(10):1863-1869.