肉制品中6种人工合成色素的快速测定

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(1.贵港出入境检验检疫局,广西贵港 537100; 2.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广西南宁 530028)

色素可以分为天然色素和人工合成色素。人工合成色素具有着色力强、性质较稳定、结合牢固、成本低廉等特点,因此在食品着色方面有着广泛的应用。但超标、超范围使用会造成人体被动摄入过量的食用合成色素,导致出现嗳气、偏头痛、多种过敏症状以及中毒等症状,更有甚者造成致癌、致畸、致突变等危害[1-3],所以其安全性日益受到重视。欧美、日本和我国等对合成色素允许使用的食品种类和最大使用量都做出了相应的规定[4]。我国《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)[5]对人工合成色素的使用范围及最大使用限量作了明确规定,但部分食品生产中仍然存在超范围或超量使用的情况。一些不良商家为了谋求高利润或使肉制品的外观更鲜艳,将不允许添加的色素添加到肉制品中。

目前《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》(GB 5009.35-2016)[6]方法不适用肉制品的前处理,行业标准《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测 高效液相色谱法》(SN/T 1743-2006)[7]也只适用于糖果和饮料色素的检测,国家标准《肉制品 胭脂红着色剂测定》(GB/T 9695.6-2008)[8]只是规定了肉制品中胭脂红着色剂的测定方法,而对其他种类的合成着色剂未作规定,且其前处理方法过程繁琐、工作效率低。文献[9-16]报道了几种合成色素的检测方法,但未见有同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和酸性红这6种色素的报道。本研究通过优化样品提取和测定条件,建立了一套快速准确同时测定肉制品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和酸性红6种人工合成色素的高效液相色谱方法,以期为肉制品中人工合成色素的高通量测定提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肉制品 在广西范围内市场随机采购;无水乙醇 色谱纯,天津光复精细化工研究所;氨水 分析纯,广东光华科技股份有限公司;乙腈 色谱纯,美国天地有限公司;乙醚 分析纯,四川西陇化工有限公司;乙酸铵 分析纯,广东光华科技股份有限公司;柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄溶液标准物质 浓度0.500 mg/mL,中国计量科学研究院;诱惑红标准品(纯度80.0%)、酸性红标准品(纯度95.4%) 德国Dr.Ehrenstorfer;乙醇-氨-水溶液(7∶1∶2,v/v);超纯水 自制。

Agilent 1260型高效液相色谱仪(带二极管阵列检测器) 美国Agilent公司;GM 200刀式研磨仪 德国RETSCH(莱驰)公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;L550台式低速大容量离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;LPD2500多管旋涡混合仪 莱普特科学仪器(北京)有限公司;HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;ML204/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 称取绞碎的肉制品10 g(精确至0.01 g)放入50 mL塑料离心管中,加入15 mL乙醚,在混匀器上混匀3 min,弃去乙醚,反复处理3次清除脂肪。用氮气将乙醚挥尽后,加25 mL乙醇-氨-水(7∶1∶2,v/v)溶液,漩涡混匀1 min后超声(频率40 KHz)提取30 min,4000 r/min离心5 min,上清液移入100 mL烧杯,残渣继续用乙醇氨水溶液提取,至提取液无明显颜色。合并上清液于100 mL烧杯中,将提取液置于90 ℃水浴,挥至近干。再加25 mL乙醇氨溶液,振荡混匀后4000 r/min离心5 min,收集上清液于90 ℃水浴蒸至2 mL左右,用水稀释至10 mL,取适量经0.45 μm滤膜过滤,待测。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);柱温:35 ℃;流动相:A相为0.02 mol/L乙酸铵溶液,B相为乙腈,流速:0.8 mL/min;梯度洗脱程序:0 min 95% A,5 min 80% A,10 min 80% A,15 min 95% A;进样量:10.0 μL;二极管阵列检测器;检测波长:柠檬黄 428 nm,苋菜红520 nm,胭脂红508 nm,日落黄482 nm,诱惑红515 nm,酸性红516 nm。

1.2.3 标准溶液的配制 浓度为0.500 mg/mL的酸性红、诱惑红标准溶液的配制:分别称取按其纯度折算为100%质量的酸性红、诱惑红标准品0.0500 g,分别置于100 mL容量瓶中,用水溶解,并用水定容至刻度。

分别准确吸取1 mL柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和酸性红母液于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成浓度50 μg/mL混合标准储备液,将混合标准储备液分别稀释为1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 μg/mL混合标准系列。检测时,在上述色谱条件下进行测定,以标准系列溶液浓度为横坐标(X)、相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的确定

2.1.1 蛋白的沉淀 在大量的实验过程中,发现当遇到蛋白质、脂肪含量高,样品基质复杂的情况时,按照国家标准《肉制品 胭脂红着色剂测定》(GB/T 9695.6-2008)提取色素步骤繁琐,合成着色剂无法被聚酰胺粉完全吸附,在洗涤的时候色素也不能完全洗涤下来,造成色素损失。

在研究中使用沉淀剂来沉淀蛋白质,但是在加入沉淀剂后,可以发现沉淀物上有颜色沉着。而且离心后也会出现絮状物漂浮,在经过水浴蒸干时,有大量的沉淀物,无法过柱,如果经过离心再过柱，肉眼只能看见少量色素富集在沉淀物上。在实验过程中比对加入沉淀剂和不加沉淀剂的回收率(详见表1),结果表明,使用沉淀剂的回收率低于不加沉淀剂的。所以可以确定在使用沉淀剂沉淀蛋白的同时,也有一部分色素随之沉淀。

表1 加沉淀剂和不加沉淀剂回收率比对表(n=6)Table 1 Recoveries of added precipitant and without precipitant(n=6)

表2 一次提取和二次提取回收率比对表(n=6)Table 2 Recoveries of single extraction and twice extraction(n=6)

2.1.2 提取次数 在第一次使用乙醇氨溶液提取色素后,提取液水浴蒸至5 mL左右,大量的蛋白质经过高温后变性产生沉淀,如果直接用水定容需要离心后才能用0.45 μm滤膜过滤,实验过程中发现这些沉淀吸附色素能力强,经过离心后色素沉着严重,特别是对含量不超过1 mg/kg的样品的影响较大。所以本方法采取二次使用乙醇氨溶液提取,由于合成色素易溶于乙醇氨溶液中,离心后色素不会随着变性的蛋白质沉淀,这样大大提高了回收率(见表2)。

2.1.3 浓缩条件 在水浴挥干乙醇-氨溶液时,水浴温度要控制在90 ℃以下,并且挥发至2 mL左右即可,如果水温过高或蒸至太干,会影响其回收率,酸性红甚至会出现检测不出的情况,与文献[17]的报道一致。

2.2 测定条件选择

2.2.1 检测波长的选择 按照《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》(GB 5009.35-2016)测定合成色素采用254 nm检测波长,在此波长下,有吸收的化学成分太多[18],测定时容易受样品中其他成分干扰,峰重叠现象严重,无法明显分离,特别是对于一些成分复杂的样品,样品中的其他杂质与目标物质分不开。6种色素选择不同波长检测,色谱峰分离效果明显(见图1),相互干扰现象大大降低。

2.2.2 流动相条件的选择 文献[19]证实在甲醇中加入适量的乙腈作为流动相能够有效地提高色谱峰的对称性,本研究发现单独使用乙腈也可以很好得分离柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和酸性红这六种色素。采用0.02 mol/L乙酸铵-乙腈溶液作为流动相,为了利于色谱峰的分离,多次对流动相的比例进行调整,后来发现乙酸铵和乙腈在流动相中比例的变化可以提高分离效果,故采用梯度洗脱条件,6种色素得到较好的分离,并能得到理想的色谱图(见图1)。

2.3 干扰物质的排除

本方法虽然采取不同波长对6种色素分别进行检测,避开大部分干扰物质的吸收,但是肉制品样品本身环境十分复杂,除含有大量的脂肪和蛋白质成分外,一些经过加工处理的样品,如牛肉条、猪肉条等小吃类的肉制品,由于添加物质多,样品处理后杂质也较多,检测样品时,出现的可能是杂质峰,可用6种色素的特征光谱进行确认。核查该物质的光谱时,与相应对照品光谱比对,如光谱一致,则确认检出目标色素,反之则可以排除。样品加标和空白样品按照1.2.1方法进行前处理、标准溶液按照1.2.3方法配制,后于1.2.2条件下检测,6种人工合成色素保留时间重现性好,样品处理后无明显干扰,其标准溶液、样品加标和空白样品的色谱图见图1～图3。

图1 浓度为10 μg/mL的混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of 10 μg/mL mixed standard solution

图2 空白样品添加10 μg/mL混合标准色素的标准溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of blank sample added with concentration of 10 μg/mL mixed standard solution

2.4 标准曲线及检出限

将混合标准系列溶液在1.2.2色谱条件下进行分析,以混合标准系列溶液浓度为横坐标(X),相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。回归方程、相关系数及线性范围、方法的检出限(按3倍信噪比计算)见表3。

表3 线性范围、标准曲线回归方程、相关系数及检出限Table 3 Standard curve of regression equation,correlation coefficient and linearity ranges

图3 空白样品色谱图Fig.3 Chromatogram of blank sample

2.5 回收率及精密度

分别称取10 g(精确至0.01 g)经过绞碎混匀的肉制品共20份,加入混合标准溶液,添加量相当于1、2、10 mg/kg的平行样品各6份,其中2份不加标准溶液作为本底样品,按照方法1.2.2进行测定,检测本底样品不含6种色素。经计算,柠檬黄的回收率为87.19%～90.86%、苋菜红的回收率为70.33%～78.93%、胭脂红的回收率为80.47%～88.43%、日落黄的回收率为86.98%～90.32%、诱惑红的回收率为86.24%～93.08%、酸性红的回收率为72.03%～79.53%。样品的平均回收率、相对标准偏差结果见表4。

表4 回收率、精密度实验结果(n=6)Table 4 Result of recovery and precision(n=6)

2.6 样品的测定

按照本实验方法测定了从大型超市抽取的86个样品和从农贸市场抽取的44个熟食样品,抽取的这些样品包含了叉烧、盐焗鸡、烧鸭、卤鸡爪、腊肠、腊肉、卤猪脚、卤鸭脖、火腿、牛肉干和猪肉干等。结果显示大型超市的检出率比较低,仅有2个样品检出,其中一个检出酸性红,另一个检出柠檬黄。农贸市场检出率比较高,44个样品中共有15个样品检出添加有1种或几种色素,主要是柠檬黄、胭脂红、日落黄和诱惑红,检出率为34%,有的色素添加浓度甚至高达300 mg/kg。本课题还从市场抽取了25个生鲜类样品,包括鸡肉、牛肉、猪肉,按照此方法进行检测,均未检出添加色素。

3 结论

本方法不需吸附、过滤、解析等步骤,前处理操作便捷、快速,能在较短时间内实现对柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和酸性红6种合成色素的检测,有较好的回收率和精密度,加标回收率为70.33%～93.08%,检出限为0.12～0.21 mg/kg,相对标准偏差均小于5%,表明该方法检测结果准确、可靠,为肉制品中违法或超量添加各种色素的监督检验提供了科学的方法,具有很好的实际应用价值。

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