不同色谱柱对37种脂肪酸甲酯的分离条件优化及分离效果比对

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(1.湖南省林产品质量检验检测中心,湖南长沙 410007; 2.湖南省电子科技职业学院,湖南长沙 430100)

脂肪酸具有重要的营养价值及独特的功能作用,是油脂化工的基础原料。以天然脂肪酸为原料衍生的下游产品,广泛用于纺织、食品、医药、日用化工、石油化工、橡塑、采矿、交通运输、铸造、金属加工、油墨、涂料等各种行业。亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等在人体器官的成熟发育及疾病的治疗等方面有着至关重要的作用,食品中脂肪酸的检测已成为食品检测领域的重点工作[1-4]。

现阶段对于脂肪酸成分的分析检测手段有滴定分析法、毛细管气相色谱法、傅立叶变换红外光谱法、气相色谱法以及气相质谱-质谱连用[5]。Tyburczy等[6]采用傅立叶变换红外光谱(ATR-DTIR)和气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID),对25种食用油脂肪酸样品进行对比分析,发现两种方法得出的结果差异显著,气相色谱法更适合反式脂肪酸中某些组分的检测。汤富杉等[7]采用GC-FID法测定,研究比较油茶籽油和橄榄油中脂肪酸组成,脂肪酸甲酯都能得到很好的分离,取得分析效果较理想。韩深等[8]测定橄榄油中六种脂肪酸,用配有氢火焰离子化检测器(FID),结果表明该方法快速、灵敏且回收率好。[9-10]对于脂肪酸甲酯(FAME),分子量和沸点几乎是相同的,唯一的差别是由分子上的氢异构位置导致的偶极相互作用不同。只有在固定相中存在强偶极相互作用,才能对这些类型的化合物进行色谱分离[9-11]。高宏等[12]比较食品中反式脂肪酸在100 m和30 m毛细管石英柱的分离效果。结果发现100 m长色谱柱耗时稍长,存在出峰顺序颠倒现象;30 m长色谱柱耗时短,部分反式脂肪酸不能完全分离但并不影响结果。霍权恭等[13]采用SPB-1701中等极性毛细管柱对白酒中甲醇、杂醇油、酯类进行分离,检测结果表明SPB-1701色谱柱耐高温、耐氧化性、分离效能高,比极性毛细管柱更实用。刘有添等[14]在乌贼膏脂肪酸组成的检测工作中对色谱柱进行考察,选用非极性HP-5柱、极性HP-INNOWax柱和强极性HP-88柱对40种脂肪酸甲酯混标进行分离。发现只有在HP-88柱大部分出峰均达到基本分离。王海军等[15]验证强极性色谱柱Sp-2560与弱极性色谱柱Rtx-5检测效果比较中,强极性色谱柱对于脂肪酸有较好的分离效果。

强极性色谱柱Wondacap-wax常用于芳香烃,醇类,醛类、乙二醇、苯乙烯、对二甲苯。Rt®-2560是FAMEWAX,与其他色谱柱相比,FAMEs在FAMEWAX柱上的出峰顺序是一致的,但基线稳定所需的时间明显减少,食品、风味物质、芳香物质之多不饱和脂肪酸甲酯分析;中等极性色谱柱Rt®-1701对杀虫剂、除莠基及药物的分析具有选择性,利用中等极性色谱柱对脂肪酸甲酯进行分离的文献报道较少。

本文选用强极性色谱柱Wondacap-wax、Rt®-2560及中等极性色谱柱Rt®-1701对37种脂肪酸甲酯混合标准品进行分析检测,通过比较极性色谱柱长度30 m(Wondacap-wax)和100 m(Rt®-2560)对脂肪酸甲酯的分离能力的影响,强极性固定相与中等极性固定相保留脂肪酸甲酯化合物的能力,筛选已经过优化的色谱条件得出对应色谱柱的最佳分离效果,并分别采用不同色谱柱的最优条件对同一茶籽油样品检测,为快速而准确检测食用油脂肪酸成分提供研究参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

37种脂肪酸甲酯混标(Supelco) 美国Sigma公司;压榨茶籽油 长沙马王堆市场;异辛烷 色谱纯,天津致远;氢氧化钠、甲醇、硫酸氢钠等均为分析纯。

GC-2010plus气相色谱仪 日本岛津公司;Wondacap-wax色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 日本岛津公司;Rt®-1701色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国Restek公司;Rt®-2560色谱柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm) 美国Restek公司;AL204电子天平 上海梅特勒。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法 参照GB 5009.257-2016对食用油样品进行预处理,待测样品采用酯交换法处理,称取试样60.00 mg至10 mL具塞试管中,加入异辛烷溶液(色谱纯)4 mL,然后再加入200 μL氢氧化钠甲醇溶液(2 mol/L)。盖上玻璃塞后猛烈摇晃30 s,使氢氧化钠溶液充分酯交换甲酯化。静置至澄清后,加入约1 g硫酸氢钠中和氢氧化钠,再次猛烈摇晃后静置,取上清液进行气相色谱分析。

1.2.2 气相色谱分析条件 不同的色谱柱柱流失温度有差异,并且所测的标准品组分复杂,色谱柱的选择及分析条件很关键。本实验选用极性Wondacap-wax柱、极性Rt®-2560柱、中等极性Rt®-1701柱,对37种脂肪酸甲酯混标样品进行分离。默认实验条件:FID检测器、载气为氮气,进样量1 μL,柱流量1 mL/min,氢气流量30 mL/min,空气流量300 mL/min,分流比30∶1[16-18]。

1.2.2.1 极性Wondacap-wax柱 方法a:进样口温度250 ℃;检测器温度250 ℃;程序升温:140 ℃(5 min)以4 ℃/min上升至230 ℃(10 min);分流比50∶1。

方法b:进样口温度250 ℃;检测器温度250 ℃;程序升温:130 ℃(5 min)以5 ℃/min上升至220 ℃(10 min)。

方法c:进样口温度240 ℃;检测器温度240 ℃;程序升温:135 ℃(3 min)以2 ℃/min上升至220 ℃(20 min)。

1.2.2.2 极性Rt®-2560柱 方法a:进样口温度250 ℃;检测器温度250 ℃;柱流量1.3 mL/min;程序升温:140 ℃(5 min)以1.8 ℃/min上升至220 ℃(10 min)。

方法b:进样口温度270 ℃;检测器温度280 ℃;程序升温:100 ℃(13 min)以10 ℃/min上升至180 ℃(6 min),以1 ℃/min上升至200 ℃(20 min),以4 ℃/min上升至230 ℃(10.5 min);分流比100∶1。

方法c:进样口温度250 ℃;检测器温度260 ℃;程序升温:140 ℃(5 min)以5 ℃/min上升至240 ℃(30 min)。

1.2.2.3 中等极性Rt®-1701柱 方法a:进样口温度250 ℃;检测器温度260 ℃;柱流量0.7 mL/min;程序升温:60 ℃(2 min)以10 ℃/min上升至180 ℃(1 min),以10 ℃/min上升至180 ℃(1 min);以2 ℃/min上升至220 ℃(20 min),以2 ℃/min上升至260 ℃(20 min)。

方法b:进样口温度220 ℃;检测器温度250 ℃;柱流量2.0 mL/min;程序升温:70 ℃(5 min)以10 ℃/min上升至230 ℃(5 min);氢气流量40 mL/min,空气流量450 mL/min,尾吹流量45 mL/min。

方法c:进样口温度250 ℃;检测器温度250 ℃;程序升温:140 ℃(5 min)以5 ℃/min上升至240 ℃(5 min)。

2 结果与分析

FAME的出峰顺序为按照碳数由低到高顺序出峰,同一碳数的FAME,不饱和的先出峰,不饱和度越高,出峰越早。高柱温能够缩短保留时间,使样品中的组分完全流出,但是不利于分离。柱温低则有利于样品的分离,但对峰形有影响。实验的结果不仅要考虑是否得到较好的分离,还要考虑检测时长、分离度等因素。

表1 部分色谱峰分离效果对比Table 1 Comparison of chromatographic peak separation effect

注：“-”:表示未分开,表2同。

2.1 极性Wondacap-wax柱最佳分离结果

方法a和方法b最后的出峰数量均少于37种,出现重叠峰现象。未能达到理想的分离效果,而方法c各组分已经达到了分离要求,灵敏度较高。如图1所示。

图1 色谱柱Wondacap-wax在最佳条件下对脂肪酸甲酯混合标准品的分离Fig.1 Separation results of mixed standard fatty acid methyl ester under the optimal condition with chromatographic column Wondacap-wax

2.2 极性Rt®-2560柱最佳分离结果

方法b和方法c耗时短但未能达到理想的分离效果,而方法a得到脂肪酸甲酯标品分离效果没有产生拖尾。如图2所示。

图2 色谱柱Rt®-2560在最佳条件下对脂肪酸甲酯混合标准品的分离Fig.2 Separation results of mixed standard fatty acid methyl ester under the optimal condition with chromatographic column Rt®-2560

2.3 中等极性Rt®-1701柱最佳分离结果

方法a和方法b未能达到理想的分离效果,而方法c,脂肪酸部分分离结果得到改善但峰型较差,如图3所示。

图3 色谱柱Rt®-1701在最佳条件下对脂肪酸甲酯混合标准品的分离Fig.3 Separation results of mixed standard fatty acid methyl ester under the optimal condition with chromatographic column Rt®-1701

2.4 三种色谱柱的分离效果分析

色谱中评价色谱柱总分离效能的指标是分离度,又称为分辨率,即为相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比,用R(Resolution)表示,常用作色谱柱分离效能指标。当R<1时,两峰有部分重叠,当1.0≤R<1.5时,分离度达到98%,色谱峰基本分离;当R≥1.5时,分离度可达99.7%,色谱峰完全分离。

通过比较色谱柱对脂肪酸标准品的分离效果,由三种色谱柱最佳分离色谱峰结果(见表1)可知,极性Wondacap-wax柱基本都能分离出来,但是耗时最长,不同成分之间分离度差距很明显;极性Rt®-2560柱基本都能分离出来,耗时较短,分离度比较均衡;中等极性Rt®-1701到了30 min后出峰重叠或分叉现象频繁,10号实现基本分离,23号、30号未分开。因此,强极性色谱柱更适合应用于油脂中脂肪酸分离检测,中等极性色谱柱虽然分离效果不佳,但是对于单个脂肪酸成分的检测中,分离度有所改善[19-20]。

2.5 最佳条件对同一种样品检测结果比较

表2 不同色谱柱对食用油样品检测结果Table 2 Results of edible oil samples by different chromatographic column

在实验最佳分离条件下不同色谱柱对同一茶籽油样品检测,结果见表2,各色谱柱的分离度都大于1,强极性色谱柱Rt®-2560检测的峰面积是三者中最大的,而强极性色谱柱Wondacap-wax检测用时最短,在25 min内完成分析。中等极性色谱柱Rt®-1701峰面积最小,出峰时间普遍较长。3号和4号未完全分离,可能是因为柱填充或分流比等因素的影响。由于油脂当中脂肪酸成分复杂,脂肪酸成分的碳数、不饱和度、顺反构象以及双键的位置都会对出峰时间和峰形有影响。5号的出现可能是因为分离不完全产生的偏离,亦或是检测器噪音干扰。

图4 不同色谱柱的色谱图Fig.4 GC chromatogram map from different chromatographic column

3 结论

本研究采用3种色谱柱实验分离37种脂肪酸甲酯成分,并通过对同一食用油样品检测,进行结果比对分析。

结果表明,通过改变柱温、升温程序以及升温速度等条件,是可以改善混合标准品分离度。色谱柱长度越长柱效越高,分离度越好。Rt®-2560色谱柱的分离效果最好,其次是Wondacap-wax色谱柱,中等极性色谱柱Rt®-1701可能更适合分离部分功能性脂肪酸成分,不适合用于脂肪酸37种标准品的分离。

GC条件均参考相关分离检测研究文献,因色谱柱条件、仪器等因素影响难以避免的存在误差,但不影响检测结果,Rt®-2560柱的分离效果还有改善的空间。分析比较脂肪酸组成,对食用油的营养评估、品质分级、鉴别以及风险预估具有重要意义,有利于更好地开发和推广我国特色食用油资源。

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