分子印迹固相萃取小柱－高效液相色谱法测定辣酱中4种苏丹红

程晓宏，杨 俊，周 楠，史玉坤

（1．南通市食品药品监督检验中心，南通226006； 2．南通市疾病预防控制中心，南通226007）

苏丹红，又名“苏丹”，是人工合成的偶氮类、油性化工染料，被广泛应用于油、蜡的增色及鞋、地板等的增光方面。由于苏丹红染色后的食品颜色鲜艳且不褪色，能刺激消费者的购买欲和食欲，一些不法商家非法添加苏丹红染料于辣椒酱、火锅底料等辣椒制品中。毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性［1］。苏丹红Ⅰ号在人类肝细胞研究中显现可能的致癌特性，在我国禁止其作为色素添加剂在食品中使用。因此，建立测定苏丹红的方法具有重要意义。

目前测定苏丹红的方法主要有液相色谱法［2－4］和液相色谱－质谱法［5－6］。国家质检总局曾发布食品中苏丹红染料测定方法的国家标准［7］。这些方法在样品经正己烷提取、中性氧化铝柱层析净化后，用反相高效液相色谱－紫外可见光检测器或质谱进行分析，采用外标法定量。但该方法使用有机溶剂多，耗时较长，而且氧化铝的活性不易控制，回收率难以得到保证。本工作采用分子印迹的原理吸附苏丹红（分子印迹固相萃取小柱能选择性地识别和富集苏丹红染料，正己烷淋洗样品中油性杂质，二氯甲烷洗脱苏丹红染料），使用有机溶剂少，耗时短，去油效果佳，克服了国家标准方法的缺点，建立了同时测定辣酱中4种苏丹红的分子印迹固相萃取小柱－高效液相色谱分析方法。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，配四元泵、在线真空脱气机、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器；AS20500BDT型超声波清洗器；MTN－2800D型氮吹仪；XW－80A型涡旋混合器；Millipore纯水仪；0．22μm亲水聚四氟乙烯（PTFE）针式滤膜；苏丹红专用分子印迹固相萃取小柱。

苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准储备溶液：1．0g·L－1，称取苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准品各0．100 0g，经乙醚溶解后用正己烷定容于100mL容量瓶中。

乙腈为色谱纯，乙醚、正己烷、丙酮、二氯甲烷、冰乙酸为分析纯，试验用水为二级纯水。

1．2 色谱条件

ZORBAX SB－C18色谱柱（4．6mm×150mm，5μm）；进样量为20μL；柱温为35 ℃；流量为1．0mL·min－1；检测波长为500nm。流动相：A为0．1%（体积分数，下同）乙酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～4min时，A为20%；4～14min时，A由20%线性降至0，保持6min；20～22min时，A由0线性升至20%，保持3min。

1．3 试验方法

1．3．1 样品制备

称取混合均匀的样品0．50g于10mL比色管中，加入正己烷－丙酮（3＋1）混合液5mL稀释，用超声波水浴提取10min，漩涡混匀，快速定性滤纸过滤，反复提取两次后合并提取液，得样品上清液，再经45℃氮吹至近干后，用正己烷5mL溶解残渣，备用。

1．3．2 分子印迹固相萃取小柱活化与平衡

将苏丹红专用分子印迹固相萃取小柱放置在固相萃取装置上，使用前先采用二氯甲烷5mL活化，再用正己烷5mL平衡固相萃取小柱。

将上述备用液全部上样（上样前确保固相萃取小柱的湿润），用正己烷5mL进行淋洗，用二氯甲烷5mL进行洗脱。将收集的洗脱液在45℃下氮吹至近干，用乙腈1mL定容，过0．22μm 亲水PTFE针式滤膜，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

苏丹红混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 苏丹红混合标准溶液的色谱图Fig．1 Chromatogram of sudan mixed standard solution

2．2 试验条件的选择

苏丹红染料属于油性染料，能较好地溶解于正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇等有机溶剂中。乙酸乙酯、乙腈、甲醇可较好地从样品中提取出苏丹红，但是它们的沸点较高，考虑到提取液需要氮吹，它们不适合作为提取试剂。因此，选择正己烷和丙酮作为样品提取试剂。由于辣酱样品中含水量较大，试验选用正己烷－丙酮（3＋1）混合液作为提取试剂。再根据实验室的条件，选择氮吹仪辅助45℃浓缩提取液。

苏丹红Ⅰ的最大吸收在480nm左右，苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ的最大吸收在500nm左右、苏丹红Ⅳ的最大吸收在520nm附近，综合兼顾4种苏丹红染料，试验选择检测波长为500nm。

国家标准方法［7］中使用不同比例的甲酸、乙腈、丙酮混合液作为流动相，操作繁琐，且分析时间长达40min。由于甲酸易燃烧、易还原，且凝固点较低，试验选择乙酸替代。为简化流动相配制过程，试验选择流动相A为0．1%乙酸溶液，流动相B为乙腈。

试验提高乙腈初始比例和梯度变化速率，还对梯度程序的初始冲洗时间、最后冲洗时间进行了合理缩减，选择的梯度洗脱程序见1．2节。

试验选择流量为1．0mL·min－1，进样量为20μL。35℃比室温（25℃）更稳定，为了获得较好的重复性和再现性，试验选择柱温为35℃。

2．3 标准曲线和检出限

用乙腈将1．0g·L－1苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准储备溶液逐级稀释成混合标准溶液系列。按仪器工作条件对上述混合标准溶液系列进行测定，并绘制标准曲线。结果表明：苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的质量分数均在0．1～5．0mg·kg－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程、相关系数见表1。

表1 线性回归方程和相关系数Tab．1 Linear regression equations and correlation coefficients

以3倍信噪比计算苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的检出限（3S／N）均为10μg·kg－1。

2．4 精密度与回收试验

按试验方法对空白辣酱样品进行加标回收试验，平行测定6次，结果见表2。

表2 精密度与回收试验结果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：日内相对标准偏差（RSD）不大于6．0%，日间RSD小于8．0%，该方法具有较好的精密度。

2．5 样品分析

试验选取某超市的20份辣酱样品，按试验方法进行测定，结果均为未检出。某阴性样品及其加标（0．2mg·L－1）的色谱图见图2。

图2 样品的色谱图Fig．2 Chromatograms of the sample

由图2可知：阴性样品杂质峰大幅减少，分子印迹固相萃取小柱能较好地净化基质杂质和富集苏丹红染料。

本工作采用分子印迹固相萃取小柱－高效液相色谱法测定辣酱中4种苏丹红。分子印迹固相萃取小柱重复性好，该方法具有操作简便、快速、稳定性好、回收率高等优点，能满足辣酱中苏丹红的定性分析和定量分析要求。

［1］ 师邱毅，纪其雄，许莉勇．食品安全快速检测技术及应用［M］．北京：化学工业出版社，2010．

［2］ 李盛安，冯敏铃，李拥军．超高效液相色谱法测定番茄酱中4种苏丹红染料残留效果研究［J］．现代农业科技，2013（9）：279－280．

［3］ 邸万山．高效液相色谱内标法测定辣椒制品中苏丹红［J］．中国食品添加剂，2016（3）：171－174．

［4］ 史俊文，刘凤芝，张越．凝胶渗透色谱净化－高效液相色谱法测定辣椒制品中的苏丹红染料［J］．理化检验－化学分册，2015，51（1）：57－60．

［5］ 杜振霞，孙姝琦．超高效液相色谱－串联四极杆质谱联用分析鸭蛋黄中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ［J］．色谱，2007，25（5）：705－710．

［6］ 赵延胜，储晓刚，王菡，等．液相色谱／四极杆－飞行时间质谱对人造奶油中苏丹类染料的检测［J］．食品安全质量检测学报，2011，2（2）：59－66．

［7］ GB／T 19681－2005 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法［S］．