淡水鱼虾细菌病诊断与防控技术研究进展

蔺凌云，潘晓艺，袁雪梅，姚嘉赟，徐 洋，尹文林，沈锦玉

（浙江省淡水水产研究所，浙江省鱼类营养与健康重点实验室，浙江湖州 313001）

1 淡水鱼虾主要细菌病

1.1 淡水鱼主要细菌病

1.1.1 细菌性败血病（暴发性出血病） 该病是危害最大、流行地区最广、流行季节最长、造成损失最严重的一种淡水养殖鱼类急性传染病。已报道的病原包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和维氏气单胞菌等[1-3]。根据以下临床症状和病理变化，可初步作出诊断：病鱼全身广泛性充血、肛门红肿，腹部膨大；肝、脾、肾、胆囊肿大充血，部分鱼可见严重肌肉充血。

1.1.2 细菌性肠炎 这里的肠炎病专指肠道致病菌所引起的一种传染性疾病，草鱼和青鱼最易发病。报道的病原有嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和肠型点状气单胞菌等[4-5]。可根据以下两点做出初步判断：一是肠道充血发红，尤以后肠段明显，肛门红肿、外突，肠腔内有很多淡黄色黏液；二是从肝、肾或血中可以检出产气单胞菌。

1.1.3 细菌性烂鳃 此病发病季节长，流行范围广，在各养殖阶段都易发生，常造成大批鱼种死亡。其病原为柱状黄杆菌[6]。根据鱼体发黑、鳃丝肿胀、黏液增多、鳃丝末端腐烂缺损、软骨外露等症状，可进行初步诊断。

1.1.4 链球菌病 该病是养殖鱼类重要的细菌性疾病之一，是近年来罗非鱼的主要病害。其病原有海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房链球菌和格氏乳球菌[7-8]。主要诊断依据为鱼在水面做螺旋状或旋转游动，身体呈“C”形或逗号形弯曲；慢性感染的鱼以眼球突出、浑浊等症状作出初步诊断依据。

1.1.5 迟缓爱德华氏菌病 该病是由迟缓爱德华氏菌引起的鱼类和牛蛙等水生动物疾病的统称。可根据患病鱼的症状和流行情况，作出初步诊断：用解剖针刺穿病鱼病灶部位有脓状物流出，肾脏和肝脏明显肿大，并大多伴有脓肿病灶，肛门周围红肿。

1.1.6 鮰类肠败血症 鮰类肠败血症是由鮰爱德华氏菌引起的一种细菌性疾病，临床上以头盖穿孔或肠道败血为特征，主要感染鮰科鱼类。可根据病鱼头盖穿孔、肠道败血和其他内脏器官有出血、坏死等典型症状作出初步诊断。

1.1.7 诺卡氏菌病 病鱼大体上分为躯干结节和鳃结节2种类型。诺卡氏菌可用选择性培养基分离培养。另在病鱼结节处取少许脓汁制成涂片，革兰氏染色，如镜检发现阳性丝状菌，可初步诊断。

1.2 淡水虾主要细菌病

1.2.1 急性肝胰腺坏死病 2010年以来，该病在我国迅速扩散，只要流行于亚太对虾重要养殖区。目前，多数学者认为其病原为携带编码毒素蛋白pirAB质粒的特异弧菌，其中报道最多的是副溶血弧菌[9-11]。此外，欧文斯氏弧菌[12]、坎贝氏弧菌[13-14]及哈维氏弧菌进化枝的成员[15]也可引起对虾急性肝胰腺坏死病，这些弧菌均携带有编码毒力蛋白pirA和pirB基因的质粒。已建立的分子诊断技术，包括常规 PCR[16-18]、qPCR[19]和 LAMP[20-21]，均是以该毒力蛋白基因为靶基因进行检测的。也可采用TCBS平板培养观察绿色菌落的数量，作为预测和初步诊断的手段。

1.2.2 螺原体病 近年来，在克氏原螯虾、南美白对虾、罗氏沼虾及青虾中相继发现了螺原体感染的病例[22-24]。利用螺原体侵染血细胞后形成包涵体及病原体具游动性的特点，通过光镜可进行快速诊断。

2 淡水鱼虾主要细菌病害诊断技术

2.1 基于病原菌生理生化特征的检测方法

从发病鱼虾中分离病原细菌，通过培养物特征（菌落形态、菌体形状等）及生理生化实验进行细菌病害的初步诊断，是最常用和最基本的检测方法。刘杰等[25]采用API 20 NE生理生化检测试剂盒与16S rDNA基因序列比对，对导致黄颡鱼暴发性流行病的病原进行了鉴定，确定为嗜水气单胞菌。

2.2 基于分子生物学技术的检测方法

2.2.1 常规定性PCR检测方法 该方法特异性强、操作简单，可快速识别检测样品中的微量病原菌，是水产病害快速检测中应用最为广泛和成熟的方法，包括普通PCR、巢式PCR和多重PCR。Dangtip等[18]以副溶血弧菌毒力蛋白基因ToxA和ToxB为靶基因，建立了巢式PCR，可快速检测引发对虾急性肝胰腺坏死病的致病性副溶血弧菌，其灵敏度较一步法PCR提高了100倍。艾克特等[26]建立了一种以鮰爱德华氏菌Ser C基因、肺炎克雷伯菌Khe基因、迟钝爱德华氏菌Muk F基因和嗜水气单胞菌Hly A基因等为目的基因的多重PCR，检测出患病黄鳝体内感染的细菌主要是肺炎克雷伯菌和嗜水气单胞菌。

2.2.2 实时定量PCR技术（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 基 于 对PCR进程进行实时检测的实时定量PCR技术，通过对水生动物的细菌感染状况定量分析，可为水生动物细菌病害的早期预防和控制提供有力的科学依据。Su等[27]以无乳链球菌16-23S rRNA基因间隔区为靶序列，建立了检测无乳链球菌的SYBR Green I qPCR，20 µL反应体系中最低可检测出8.6个拷贝的目的DNA。该方法为无乳链球菌在被感染鱼体各器官中的分布及增殖情况提供了一种定量工具。

2.2.3 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 该方法在恒温（65 ℃左右）条件下就可以完成核酸扩增，反应结果可直接肉眼观察。目前，LAMP已被用于多种淡水鱼虾细菌病原的检测，如嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌、海豚链球菌和无乳链球菌等。Zhou等[28]设计开发的LAMP芯片，自动化程度高，样本及试剂用量少，30 min内可同时检测10种水产病原菌。与传统的微生物学方法相比，该LAMP芯片的临床灵敏度和特异性分别为96.2%和93.8%。

2.2.4 16S rRNA检测技术 16S rRNA基因片段的分析方法主要有克隆测序、探针杂交和酶切片段多态性分析。目前，该技术被广泛应用于水产养殖细菌病原的检测。王国良等[29]从患典型症状的乌鳢体内分离病原菌，对其16S rRNA基因序列进行测定，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发生树。结果表明，该菌株的16S rRNA基因序列与诺卡氏菌属的相似性达99.9%，据此鉴定菌株为鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）。

2.2.5 核酸探针杂交法 利用特异性标记DNA或RNA探针同病原微生物中与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交，以此确定宿主是否携带特定病原，具有灵敏度高、特异性强和诊断快速等优点。Soltani等[30]根据链球菌属和乳球菌属的16S rRNA保守区设计引物，通过PCR扩增菌株靶序列，扩增产物与预先标记在膜上的特异性寡核苷酸探针进行反向线点杂交、显影。该技术能快速、敏感和特异地检测海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房链球菌和格氏链球菌4种常见水产病原细菌。

2.2.6 基因芯片技术 基于核酸杂交技术发展起来的基因芯片技术，适用于大规模、高通量的病害检测，可实现对多种靶基因的同时检测。Shi等[31]根据细菌16S rDNA设计寡核苷酸探针构建基因芯片，对包括副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和海豚链球菌在内的8种常见鱼类病原菌进行检测。结果表明，该方法与微生物常规培养和16S rRNA基因测序方法一致，适用于水产病害的初步诊断及水产动物体内潜在病原菌的快速鉴定。

2.3 基于免疫学相关技术的检测方法

2.3.1 免疫酶技术 该方法利用了抗原-抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定，达到病原鉴定及定量的目的。酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和斑点杂交（Dot-ELISA）是目前应用最广泛的免疫酶技术。祝璟琳等[32]建立了无乳链球菌的间接ELISA快速检测法，与海豚链球菌等其他常见水产病原菌无交叉反应。不仅能够检测已发病的罗非鱼，而且能够检测无症状的带菌罗非鱼，该方法的建立有助于快速准确地诊断由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病。

2.3.2 免疫荧光技术 利用某些荧光素，通过化学方法与特异性抗体结合制成荧光抗体，产生荧光，借助荧光显微镜可检测或定位被检病原。王淑娴等[33]通过不同颜色的量子点，标记副溶血弧菌抗体和迟缓爱德华氏菌抗体，加入氧化石墨烯淬灭荧光，构建了捕获目标细菌的探针。副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的检出限分别为1.5×104和2.1×104CFU/mL，在病原的早期诊断中具有良好的应用潜质。

2.3.3 胶体金免疫层析技术 该技术以胶体金为标记物，利用特异的抗原抗体反应来放大反应，通过直接观察颜色变化就可以判定结果，具有快速、简便、不需要专业仪器设备和结果肉眼可辨等优点，适用于生产一线养殖户临床及现场检测。有学者针对淡水鱼虾主要病原菌制备了多种胶体金免疫层析试纸条，如嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌、柱状黄杆菌和海豚链球菌等。

2.3.4 抗体芯片技术 抗体芯片多采用双抗夹心法，将多种特异性抗体高密度、有序地固定在处理后的芯片载体上，用于捕获待检样品中的靶抗原。可对多个样品中的多种抗原进行平行检测，操作简便，检测结果肉眼可见。李永芹等[34]制备了针对6 株鱼类常见病原菌的检测免疫芯片，可同时检测链球菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌、迟钝爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌和海分支杆菌。

3 淡水鱼虾细菌病的防控技术

3.1 监测预警防控技术

水产动物病原快速检测技术的发展，极大地促进了水产动物重大疫病的监测和预警工作。目前，农业农村部已启动了国家水生动物疫病监测管理系统，加强了对重大疫病的监测和流行病学调查，根据各地上传的监测数据自动按照预警级别分析形成预警数据。各地可根据预警级别有针对性地采取相应预防措施。

3.2 免疫防控技术

免疫防控是控制淡水鱼虾细菌性流行病最有效的方法。据不完全统计，国外已批准100余种针对24种水产病原鱼类的疫苗上市。我国鱼类疫苗的研究起步较晚，目前研制的针对大宗淡水鱼类的疫苗也有近20种，多种疫苗在实验室显示出良好的免疫保护效果，部分疫苗进入田间试验阶段，其中嗜水气单胞菌灭活疫苗已取得新兽药证书。

免疫增强剂能够提高鱼体产生抗体的能力，同时也是有效增强鱼虾非特异性免疫力的有效方法。目前已开发出脂多糖[35]、壳寡糖[36]和植物提取物[37]等免疫增强剂，部分在生产上得到了应用。

3.3 药物防控技术

目前，抗生素及某些化学药物仍然是淡水鱼虾细菌病害防治的主要手段。抗生素在有效控制水产病害的同时，也带来了病原菌耐药性增强、药物残留和水产品质量安全等问题。因此，含有免疫活性物质的中草药[38]被不断开发运用于水产病害的防治，如大蒜、大黄、五倍子、黄连和黄芩等。中草药不仅具有抗菌、抗病毒和提高鱼虾免疫功能的作用，且毒性低、毒副作用少、不产生抗药性，符合绿色渔药的开发要求，具有巨大的开发前景。

3.4 生态防控技术

生态调控通过水质调节、底质改良和科学混养等措施，增加养殖环境的生物多样性，提高养殖生态系统物质循环和能量流动的效率，为养殖动物营造稳定、健康的生存和生长环境。目前研究最多的是微生态技术[39]，通过在水体中投放有益微生物，主要是光合细菌、芽孢杆菌、放线菌、蛭弧菌、硝化和反硝化细菌等，改善水质的理化因子、菌相和藻相，为养殖动物创造了一个相对良好的生态环境。有益菌在水产动物肠道内的定植及新陈代谢产物也对其生长发育起到了一定的促进作用。

探索合适的生物防控因子，依据养殖动物的食物链耦合效应和不同生态位的配置，建立经济效益和病害防控同步提升的立体生态养殖模式。如在浙江一带应用成功的虾鳖混养，利用中华鳖对病弱虾的摄食，可有效防控南美白对虾病害的发生[40]。

3.5 综合防控技术

水产病害的发生是水环境、病原微生物及养殖动物相互作用失衡的结果，导致病害流行的因素复杂多变。因此，将病害防治各项技术进行集成以防止病害暴发，才是最有前途最有效的途径。

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