鸭圆环病毒检测方法研究进展

于新友，张 颖，李天芝

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

鸭圆环病毒病（Duck circovirus disease，DuCVD）是由鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）感染引起的一种免疫抑制性疾病[1]。各品种和日龄鸭均可感染发病，临床表现为羽毛发育不良、脱落、生长缓慢、饲料转化率降低、消瘦和贫血等[2]。单纯感染DuCV时，一般仅造成鸭零星死亡，但该病毒感染后可造成鸭免疫抑制，容易混合感染或继发其他疾病，致鸭死亡率升高，给养鸭业造成了经济损失。2003年Hattermann等[3]首先报道该病，随后世界各地均有相关报道，2006年Chen等[4]在我国台湾地区检测到DuCV感染，2006年姜世金等在我国大陆地区鸭群中检测到DuCV感染。近年来，DuCV在我国鸭群中的感染及混合感染病例呈上升趋势[5]，引起兽医界的高度关注。

DuCV属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子呈圆形或二十面体对称，无囊膜，直径约为15～16 nm，是目前已知最小的鸭病毒。该病毒对外界环境抵抗力强，一旦感染鸭群很难被清除，且目前尚不能在体外培养。DuCV是单链环状DNA病毒，基因组长约2.0 kb，有2个主要的阅读框ORFV1和ORFC1，分别编码与病毒复制有关的Rep蛋白和核衣壳蛋白Cap蛋白，病毒可分为DuCV-1和DuCV-2基因型。本文对DuCV诊断方法研究进展进行了综述，以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

1 血清学检测方法

1.1 间接免疫荧光试验（IFA）

IFA的基本原理是先用一抗处理待检细胞，形成抗原抗体复合物，再加入荧光标记抗体，在相应条件下孵育，采用荧光显微镜进行检测，如果发出荧光则表明有病毒粒子存在。张兴晓[6]根据已发表的DuCV LY0701株Cap基因序列，设计1对引物，成功扩增出目的片段，连接表达载体pGEX-6P-1，转化感受态BL21，成功表达出重组蛋白，将蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠，制备抗血清Ab-Cap，建立了DuCV IFA检测方法，应用于临床病料检测。结果显示，法氏囊、肝脏和胸腺病料样品中的病毒含量依次减少。

1.2 酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是指将抗原或抗体包被到特定反应板上，利用抗原抗体结合原理，加入相应抗体或抗原进行反应，从而实现对抗原或抗体的定量或定性检测，适合大批量样本同时检测，主要应用于抗体检测。苏小东等[7]对鸭群进行DuCV血清流行病学调查，用原核表达了全长DuCV Cap蛋白，表达的重组蛋白免疫原性良好，重蛋白纯化后作包被抗原，应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清，建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法，用建立的方法检测从江苏省部分鸭场收集的阳性血清，发现DuCV抗体阳性率约为26.7%（38/142）。

2 分子生物学检测方法

2.1 核酸探针技术

核酸探针技术是常用的分子生物学诊断技术，具有操作简单、不受抗原抗体反应的限制和结果易于判定等优点，适合在基层推广使用。Zhang等[8]利用PCR方法扩增出DuCV基因片段约228 bp，然后用地高辛标记，建立斑点杂交方法，最小可检测13.2 pg DuCV目的基因片段。邹金峰等[9]用地高辛标记DuCV全基因组克隆制成核酸探针。特异性检测结果显示，探针仅能与DuCV的核酸发生阳性杂交反应，与其他常见鸭病毒病核酸均无杂交反应；敏感性结果表明，该探针对DuCV的最低检出量约为5 pg DuCV的DNA。

2.2 常规PCR方法

常规PCR方法是根据网上公开的病原基因序列，比对分析后查找保守区域部分，设计相应引物，通过DNA聚合酶的作用，采用PCR仪，在体外大量扩增目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，从而判定检测结果，是一种快速、简便、特异的诊断方法。李志国等[10]根据DuCV-1和DuCV-2 Cap基因保守序列，分别设计2对不同的特异性引物，优化反应扩增条件后，建立了能同时检测这2种不同基因型的双重PCR检测方法。该方法检测的敏感性为1拷贝的DuCV DNA。对山东省6个不同鸭场收集的病料样品进行检测，发现鸭场中DuCV-1和DuCV-2的混合感染率为50.0%（3/6），DuCV-2单一感染率约为33.33%（2/6）。

2.3 限制性片段长度多态性聚合酶链反应

限制性片段长度多态性聚合酶链反应即PCRRFLP技术，其基本操作是先用PCR扩增目的基因，再将其用特定的限制性内切酶切成大小不等的片段，通过电泳检测基因大小，从而实现病毒的分类或分型检测。万春和等[11]根据DuCV-1和DuCV-2复制相关蛋白基因编码区核苷酸序列特征，建立一种鉴别DuCV-1和DuCV-2的聚合酶联反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法。结果表明，特异性的PCR引物可同时对DuCV-1和Du CV-2进行扩增，获得约616 nt大小的目的片段。将获得的PCR产物经KpnⅠ酶切后，发现KpnⅠ酶切DuCV-1扩产物后条带无任何变化，而DuCV-2 PCR扩增产物被切成约360 nt和256 nt 2种不同大小的基因片段。

2.4 套式PCR方法

套式PCR是根据1种病原的基因保守序列，设计2对不同的引物，即外引物和内引物，先以病原核酸为模板，用外引物进行扩增，再将扩增产物作为模板，用内引物进行第2次扩增，从而大大提高了检测敏感性。由于是以第1次扩增产物为模板，因此如果第2次能成功扩增目的基因，则表明方法具有良好的特异性。柴顺秀等[12]根据GenBank发布的DuCV保守区基因组序列，设计合成内、外2对引物，通过PCR反应条件的优化，建立了套氏PCR检测DuCV的方法。该法对4种其他鸭病原的扩增结果均为阴性，第1轮和第2轮检测的名感性分别为10 pg和0.1 pg，是常规PCR方法敏感性的100倍。蔡锐等[13]根据GenBank发布的DuCV序列，采用生物软件，设计2对引物，即外引物对和内引物对，建立了DuCV套氏PCR检测方法。应用建立的方法对从安徽不同鸭场采集的胸腺、肝脏、法氏囊等不同组织器官进行检测，发现套氏PCR扩增的目的基因大小为340 bp，该方法特异性好，对正常鸭胚、健康鸭肝脏和8种常见鸭病原扩增结果均为阴性，外引物第1次扩增检测的敏感性为1 ng DuCV DNA，内引物第2次扩增检测的敏感性为1 fg DuCV DNA，检测敏感性是单纯用外引物的106倍。

2.5 多重PCR方法

多重PCR是在PCR反应体系中加入多种引物，同时检测2种或以上疾病，可实现多种疾病的快速检测筛查，特异性好，效率高，成本低，在临床诊断中应用广泛。许宗丽等[14]等根据DuCV、鸭瘟病毒和鸭源新城疫病毒基因保守序列，分别设计3对特异性引物，通过优化PCR反应条件，建立了检测这3种疾病的多重PCR检测方法，对DuCV、鸭瘟病毒和鸭源新城疫病毒3种病毒核酸扩增的目的基因大小分别为338、576和823 bp，检测的敏感性分别为 4.67×102、1.12×103和2.59×103拷贝/µL。张艳芳等[15]针对Gen Bank中坦布苏病毒E基因和DuCV REP基因的保守序列，设计合成了2对引物，通过优化反应体系条件及特异性和敏感性评价，建立了双重PCR检测DuCV和鸭坦布苏病毒的方法。敏感性检测结果显示，该法对2种病毒基因组检测敏感性均为100 fg；特异性检测结果显示，该方法特异性良好，对鸭常见的其他病毒，如H9亚型禽流感病毒、番鸭细小病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒和减蛋综合征病毒等，其核酸扩增结果均为阴性。曹慧慧等[16]为建立能同时检测并区分DuCV和鹅圆环病毒（Goose circovirus，GoCV）的方法，根据DuCV和GoCV基因组的保守区域设计2对特异性引物，预期特异性扩增DuCV和GoCV片段大小分别为192 和556 bp。优化了扩增反应条件后，建立了DuCV和GoCV双重PCR检测方法。特异性检验表明该方法无法扩增其他水禽病原，DuCV和GoCV的最低检出限分别为104拷贝/µL和105拷贝 /µL。

2.6 荧光定量PCR方法

在PCR技术基础上发展的荧光定量PCR是一种高度灵敏的核酸定量技术，融汇了传统PCR技术和光谱技术的特点，具有可实现定量检测、灵敏度高和特异性强等多种优点。荧光定量PCR方法可分为染料法和探针法2种。染料法成本低，最常用的染料是SYBR Green Ⅰ，主要原理是与DNA双螺旋结构小沟部分结核发出荧光，对引物的特异性要求非常高，否则容易产生假阳性，探针法成本较高，各实验室可根据自身条件进行选择。赵光远等[17]根据DuCV保守基因，设计了1对引物，建立了DuCV SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法。结果显示，该法检测的敏感性达到1×102拷贝标准品DNA，特异性好，与鸭瘟、H9亚型禽流感、小鹅瘟和鸭肝炎病毒等不发生交叉反应，具有良好的重复性。许宗丽等[18]根据鸭副黏病毒（DPMV）和DuCV保守基因，设计了 2对引物和2条TaqMan探针，建立了DuCV和DPMV的双重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好，对DuCV和DPMV的检测敏感性分别达到140和160个拷贝数，该方法特异性强，对H9型禽流感病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒等的检测结果均为阴性。刘玲凤等[19]为实现对DuCV的快速检测，分析比对Gen Bank发布的DuCV全基因组序列，选择保守区域，设计了1对引物，建立了荧光PCR检测DuCV的检方法。重复性和灵敏性检测结果表明，该方法重复性良好，检测下限为67.2拷贝/µL。将建立的DuCV实时荧光定量PCR检测方法分别对鸭肝炎病毒（DHV）、大肠杆菌、新城疫病毒（NDV）、H9亚型禽流感病毒、小鹅瘟病毒（GPV）核酸或cDNA进行特异性检测，结果表明特异性良好。

2.7 环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术

LAMP技术是一种在恒温条件下进行核酸扩增的技术，只需要普通水浴锅，不需要价格昂贵的PCR仪，操作简便，反应时间短，敏感性高，特异性好，适合基层应用。赵光远等[20]根据GenBank发布的DuCV基因保守序列，应用软件设计了6条引物，并优化扩增反应体系和程序，建立了DuCV的LAMP检测方法。该方法对H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎和鸭副黏病毒核酸的扩增反应结果均为阴性，对DuCV核酸模版的检测敏感性为10 fg，是常规PCR方法的1 000倍，整个反应过程可在1 h内完成，大大提高了检测效率。

3 小结

DuCV是一种新发病毒，其相关研究还不深入，目前尚不能进行体外培养。实验室诊断方法主要有电镜观察、分子生物学诊断和间接ELISA方法。电镜法对仪器要求高，一般实验室很难达到，不能广泛应用。间接ELISA方法虽然能处理大量样品，但还没有商品化的试剂盒，且鸭群感染后抗体能持续很长时间，因此，检测抗体抗性并不能说明鸭处于发病期。分子生物学检测针对病原检测。因发病期鸭组织器官中含大量病毒，且能排毒，在临床检测中具有重要意义，所以检测时一定要选取正确的靶器官，常选取发病初期鸭法氏囊、脾脏和肝脏等组织，需尽快将样品送至实验室检测，全程保持低温，避免样品腐败变质。分子生物检测法种类繁多，各有利弊。探针法虽能检测大量样品，但操作繁琐，常规PCR大多数实验室都能开展，但检测敏感度低，不能定量；荧光PCR操作简便，对仪器和人员要求高；LAMP方法检测速度快，适合基层用，但前期研发困难，检测容易出现假阳性。不同实验室可根据自身条件选择适合的方法。随着分子生物学的发展，新型便携式仪器可能很快被研发出来，从而出现敏感性高、特异性好、价廉、可操作性强、适合广泛推广应用的新技术，为DuCVD防控工作奠定基础。

[1] 万春和，施少华，傅光华，等. 鸭圆环病毒研究进展[J]. 福建畜牧兽医，2009，31（4）：22-23.

[2] 黄瑜，万春和，彭春香，等. 鸭圆环病毒感染的临床症状[J]. 中国家禽，2013，35（5）：47-48.

[3] 姜世金，张兴晓，刘少宁，等. 患传染性浆膜炎发病鸭体内鸭圆环病毒的PCR检测[C]//中国畜牧兽医学会. 第15届世界禽病大会－中国畜牧兽医学会2007年学术年会论文集.北京：中国畜牧兽医学会，2007：258.

[4] 傅光华，程龙飞，施少华，等. 鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析[J]. 病毒学报，2008（2）：138-143.

[5] 粟艳琼，郑敏，张步娴，等. 广西鸭圆环病毒流行毒株遗传变异分析[J]. 动物医学进展，2015，36（10）：20-25.

[6] 张兴晓. 鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立[D]. 泰安：山东农业大学，2009.

[7] 苏小东，曹瑞兵，张羽，等. 鸭圆环病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立[J]. 南京农业大学学报，2011，34（5）：117-121.

[8] ZHANG X，JIANG S，WU J，et al. An investigation of duck circovirus and co-infection in cherry valley ducks in Shandong Province，China[J]. Veterinary microbiology，2009，133（3）：252-256.

[9] 邹金峰，刘少宁，雷战，等. 鸭圆环病毒核酸探针的制备与应用[J]. 中国兽医学报，2011，31（11）：1578-1581.

[10] 李志国，王鑫，张瑞华，等. 检测2种基因型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立与应用[J].中国兽医学报，2015，35（7）：1060-1063.

[11] 万春和，程龙飞，傅光华，等. 鸭圆环病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鉴别诊断方法的建立[J]. 中国家禽，2016，38（17）：53-55.

[12] 柴顺秀. 鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国畜牧兽医，2013，40（6）：104-107.

[13] 蔡锐，张小飞，潘玲，等. 鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2010，37（7）：149-152.

[14] 许宗丽，谢芝勋，谢丽基，等. 鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展，2013，34（4）：23-26.

[15] 张艳芳，谢芝勋，谢丽基，等. 鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医，2014（23）：44-47.

[16] 曹慧慧，孙文超，郑敏，等. 水禽圆环病毒双重PCR检测方法的建立[J]. 中国家禽，2015，37（22）：20-23.

[17] 赵光远，谢芝勋，谢丽基，等. 鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医，2013，45（1）：60-63.

[18] 许宗丽，谢芝勋，谢丽基，等. 鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2013，40（4）：26-31.

[19] 刘玲凤，黎振标，司兴奎. 鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国家禽，2017，39（7）：15-19.

[20] 赵光远，谢芝勋，谢丽基，等. 鸭圆环病毒LAMP可视化检测方法的建立[J]. 中国动物检疫，2012，29（3）：24-26.