代谢组学技术及其在重要寄生原虫研究中的应用

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1 前 言

寄生原虫是危害人类和动物健康的主要病原之一，其危害性以食源性寄生原虫病为主[1]，由于人们生食或半生食习惯，使得寄生原虫病的发病率大幅度升高。在畜牧业生产中，某些寄生原虫损坏动物的消化系统，使饲料动物体内的利用率降低，从而使养殖成本提高，对畜牧业造成巨大的经济损失。在公共卫生学方面，很多寄生原虫对人类有致病性，并且很多是机会致病性寄生原虫，当机体免疫正常时，这类寄生原虫感染机体后通常处于隐性感染状态，致病力弱而被忽视。一旦机体免疫受损，虫体出现大量繁殖和强致病力，严重危害着人类的健康[2]。

而在寄生原虫的研究中，组学的相关研究方法已广泛被应用。特别是后基因组学、蛋白质组学、转录组学研究方法尤为明显。但随着对寄生虫组学研究的深入，遇到的问题也愈显复杂，很多问题难以用以上三种组学研究方法解决，这三种研究方法处在生物系统生化活动调控的起始阶段，反映的是正在发生而非终止的生物学事件，因此这些分析方法所提供的信息不足以揭示生物体系生理和生化功能状态，而且在这些技术的应用过程中需要建立大量的超大序列标签数据库，再加上基因和蛋白质的种类多，这给寄生虫的研究带来了相当大的麻烦。因此一种新的寄生虫研究技术——代谢组学技术应运而生。

本文通过对代谢组学技术，代谢组学研究方法以及代谢组学在重要寄生原虫(主要是弓形虫、利什曼原虫、疟原虫、锥虫)领域的应用展开综述，把握当前代谢组学在寄生原虫研究中的最新动态，为今后寄生原虫代谢组学研究提供参考。

2 代谢组学简介

代谢组指在一个细胞中代谢物的总和[3]，由Nicholson等[4]最早提出，代谢组学是指研究在生物系统代谢的代谢途径及其受到刺激产生的所有代谢物变化的科学，这些代谢物包括不同级别分子质量小于1000的内源性小分子化合物[5],它的起源以代谢控制分析、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)光谱学的发展为两个独立的出发点[6]。

代谢组学主要借助NMR、色谱(Chromatography)、质谱(Mass Spectrometry，MS)，气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF/MS)等技术进行代谢组学研究，各种方法都有其独特的优点，往往单独应用于不同的研究中。但代谢组具有相当复杂的分子种类及浓度范围，单一技术往往难以达到研究目的，因此代谢组学研究中往往不局限于选择单一的技术，而是通过不同的分析技术的组合达到全面把握代谢组内容的目的[7]。

代谢组研究的目标是能够提供生物样品中存在的所有代谢物的复合谱。在代谢水平的细胞分析与转录组和蛋白质组分析相比具有许多优点，Janet等[8]总结了以下四个方面：1)基因和蛋白质表达的变异可以引起代谢中的变化放大，使检测更容易。2)代谢组学技术不需要完整的基因组序列或大的EST数据库。3)与基因或蛋白质相比，代谢物类型更少：每个生物体1 000个数量级。4)该技术更通用，因为给定的代谢物在每个生物体中是相同。

代谢组学在生物学研究中已经进入到一个新颖的多学科领域，它为许多研究人员提供了一个将生物化学、统计学、计算机学与深入研究生物学与疾病有力结合的平台[9]。代谢组学现已广泛应用于疾病诊断、药物开发、微生物代谢以及动植物代谢等研究中[10]。

3 代谢组学研究方法

代谢组学的终极目标是实现全面、定量分析生物系统中的所有代谢产物，使其与生理特征更为相似。但样品中代谢物具有非常不同的生化特性，并且以不同的丰度水平存在[11]，因此，代谢组学技术在不同的研究对象中研究目的和方法会有所不同[12]，但其研究方法流程大体可包括三个过程：代谢物的提取、样品分析以及数据分析[13]。

3.1代谢物的提取 代谢物的提取包括代谢物的制备以及预处理。从一个生物样品中提取最完整的代谢产物也许需要不同的制备方法[14]。对于微生物而言，至少需要顺序和同步两种的萃取过程。前者需要单独与连续淬火和代谢物提取步骤，而在后者淬火和提取都是在单个步骤中执行。代谢物提取效率高低取决于所使用的微生物和提取程序，微生物的性质似乎决定了提取的最佳方法[15]，所使用的萃取试剂会决定提取效率和提取到的代谢物的品质，例如，Mehta等[16]研究者使用皂苷使红细胞释放寄生虫，从而能特异性地分析寄生虫代谢物。

由于小分子可通过快速改变应对环境的变化，这就很难保障样品的完整性，而适当的样品预处理方法也许可以解决这一问题。比如，快速淬火以捕捉代谢活动，通常涉及温度迅速降低或增加，捕捉酶活性代谢物之后随之而来的是提取物与提取溶剂的混合。最理想的淬火方法是使用冷甲醇或水组合，但其他几个试剂组合也会被使用[16]，例如Wang等[17]研究发现常规采用的甲醇比-80 ℃的生理盐水猝灭大肠杆菌更能引起细胞膜破坏，由此证明-80 ℃的生理盐水猝灭大肠杆菌更加保留了代谢物的完成性。

3.2代谢物样品分析 代谢物的分析，主要借助于各种先进的分析技术，比如NMR，色谱，MS及其三者之间的联用等。

色谱分离技术是一个代谢物分离的关键技术，可在极其复杂的整体分析中，将混合物小分子分离开来。目前用于分离的色谱分离技术主要包括气相色谱法，液体色谱法和毛细管电泳[18]。凭借其高效分离率、设备简单、选择性强等优势广泛用于代谢组学研究的各领域中，袁凯龙等[19]利用气相色谱技术分析服用洛沙坦后的糖尿病人尿样，发现葡萄糖醇和肌醇等代谢物发生变化，并且证实了药物疗效的发展过程能够用机体不同时间点的代谢物变化轨迹进行描绘。S cubbon等[20]使用LC-MS分析人类尿液样品，证实了反相分离与亲水相互作用色谱是增加LC-MS代谢组学研究指纹覆盖率的合适方法。

MS技术是一种鉴定技术，在有机分子的鉴定方面发挥着重要作用，能够快速准确地测定生物分子的分子量。质谱通常与色谱联用[21]具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离鉴定同时进行的优点[22]，是代谢组学领域重要分析技术之一。Yang 等[23]将高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术应用于慢性乙型肝炎的肝功能急性恶化的调查以找到潜在的生物标志物，实验结果鉴定了几种慢性乙型肝炎急性恶化时潜在的生物标志物：溶血磷脂酰胆碱(LPC)和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)或其异构体甘油脱氧胆酸(GDCA)。

NMR是研究高分子链结构的重要手段，是鉴定有机物结构和研究化学动力学的重要方法，既可用于定性分析，又可用于定量分析[24]。NMR样品预处理过程相对简单;且对样品的损伤小,可在更接近生理条件下进行实验，实时和动态的检测，利用NMR谱中信号强度与样品浓度的关系, 可对代谢物进行定量分析[25]，这就使得NMR在代谢组学研究领域中不可或缺。Carrola等[26]利用NMR技术调查肺癌患者的尿液代谢标志，证实了马尿酸盐、β-羟基异戊酸盐、肌酐等是促进这种肺癌鉴定的主要代谢物。

这三种分析技术在代谢组学的应用中必不可少，根据各自的优点，都实现了其在代谢组学研究中的重要价值。三种技术之间联合应用，不仅实现三种技术优缺点的互补更是让各自的优点得到最大化的发挥，使代谢组学能解决研究中更多的疑难问题。

3.3数据分析 代谢组学分析技术分析样本，最终都会得到决定样品的特征定量数据集。然而这些数据庞大，一般的统计分析方法很难发现样品间的差异及其造成这些差异的原因[27]。因此，就出现了针对代谢组学研究的分析方法，主要包括两大类，无监督模式和有监督模式识别方法，前者主要包括聚类分析法、神经元网络分析法、主成分分析法等，后者主要包括偏最小二乘法判别分析(PLS-DA),正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等[28]。根据研究目的和研究方法的不同，合理选择对应的数据分析方法。朱晓阳等[29]综合应用LS-DA、OPLS-DA、主成分分析等分析方法分析数据，结果发现鼠伤寒沙门氏菌在共感染小鼠中发挥了作用，并且降低了日本血吸虫病对小鼠的影响。而Sengupta等[30]利用主成分分析(MPCA)方法，对雌雄小鼠的肝、脑、血清代谢分布进行多途径分析，分析表明了在疾病早期有明显的性别二态性，而在脑血清相关性分析发现了两性的能量代谢发生改变，进一步证实疾病进展期间的差异细胞器反应对疟疾操纵有影响。

4 代谢组学在重要寄生原虫研究领域的应用

代谢组学技术在寄生原虫研究中的应用相对较少，主要应用在公共卫生影响较大的寄生原虫，相关研究已经取得了突破性进展，本文通过大量的文献检索，总结了寄生虫代谢组学在重要寄生原虫研究中的应用，主要包括弓形虫、锥虫、利什曼原虫和疟原虫。

4.1弓形虫 弓形虫是一种最常见的寄生虫，危害性极大，几乎能感染所有的脊椎动物物种，包括人类[31]。弓形虫是寄生虫研究领域最热门的寄生虫之一。各种生物学研究方法几乎都有所涉及，逐渐兴起的代谢组学技术也应用在弓形虫的研究中。Srinivasan等[32]使用联合遗传、生化和代谢组学方法描绘了脂肪酸生物合成的两种途径在弓形虫的分子活性，并证实了质膜是脂肪酸的重要来源，其产物在寄生虫内质网中进一步修饰。Zhou[33]等研究者对弓形虫感染后的小鼠脑进行全代谢组学分析，对刚地弓形虫感染的小鼠代谢组学分析变化进行研究，发现其脑碳水化合物代谢、脂质代谢、能量代谢和脂肪酸氧化代谢组学途径发生改变。利用LC-MS分析技术，主成分分析等分析方法鉴定了与感染引起的疾病的身体恢复相关的八种代谢物，并且检测到的干扰代谢物和干扰途径可为发现新的治疗和诊断应用的新靶标提供有价值的信息。Zhou等[34]在另一研究中使用液相色谱-质谱法在弓形虫病发病期间小鼠血清的代谢组学分析，确定了与氨基酸代谢和能量代谢相关的19种失调的代谢物，为未来研究提供了推定的代谢物生物标志物。

4.2锥虫 锥虫分为两大类涎源性锥虫和粪源性锥虫，前者包括冈比亚锥虫与罗得西亚锥虫是非洲锥虫病的病原体[35]，全球约有一千万人感染克氏锥虫(Trypanosomecruzi)，约四千万人存在被感染的风险[36-37]。研究锥虫病，以病原的研究为主要思路，而锥虫代谢组学研究是一个新的出发点，相关研究已被大量报道。Vincent等[38]使用代谢组学技术在不同疾病阶段探测来自感染了布氏锥虫患者的脑脊髓液(CSF)，血浆和尿液样品，发现新蝶呤和5-羟色氨酸在阶段1和阶段2晚期之间显示出100%的特异性和灵敏度；5-羟色氨酸是5-羟色胺合成途径中的重要代谢物，决定嗜睡的关键途径；并且从血浆分析发现存在疾病阶段的几种生物标志物。Li等[39]使用基于1H NMR光谱的代谢分析研究了NMRI小鼠对布氏锥虫的代谢反应,发现感染布氏锥虫后2-氧代异己酸盐、D-3-羟基丁酸盐、乳酸盐、4-羟基苯基乙酸盐、苯基丙酮酸盐和4-羟基苯基丙酮酸盐的浓度增加，并且马尿酸盐水平降低，证实了丙酮酸盐，苯丙酮酸盐和马尿酸盐与寄生虫血症相关。Almutairi等[40]利用代谢组学分析蜂胶抗布氏锥虫的效应，揭示了新的蜂胶抗布氏锥虫的活性成分，并证实在蜂胶中存在一些潜在的治疗化合物，可用作新的药物开发。

4.3利什曼原虫 利什曼病是一种热带地区的致衰弱疾病[41]，约20种利什曼原虫属引起人类感染[42]。对于利什曼原虫的研究中，代谢组学研究是重要的研究方法之一。Canuto等[43]研究人员应用代谢组学技术探究利什曼原虫对米替福星作用和耐药机制，利用GC、LC、和CE耦合到MS获得了寄生虫代谢变化的图片，并发现氨基酸水平的增加是抗性寄生虫最突出的特征，证实了锑和MT部分交叉抗性的可行性，因此可找到新的多胺途径抑制剂与米替福新药物组合，甚至用作抗性的逆转剂，开启新的替代方案，以减少对利什曼原虫的用药。Vincent等[44]运用非目标代谢组学描述涉及米替福新作用的代谢变化，检测到超过800种代谢物，并发现抗锑细胞具有与野生型细胞相似的内部代谢物水平。详细了解米替福新作用模式对于指导联合治疗来防治利什曼病至关重要。Santos等[45]用两种不同的两性霉素B(AmB)制剂，负载AmB和常规制剂(C-AmB)的纳米乳剂(NE)处理观察小鼠的代谢变化，鉴定出约30种代谢物与早期C-AmB诱导的肾毒性有潜在的相关性。在C-AmB处理的小鼠中观察到花生四烯酸，甘油磷脂，酰基肉碱和多不饱和脂肪酸(PUFA)途径的干扰。在装载了AmB的NE组中，观察到代谢变化较少，包括皮质醇和吡喃糖等离子体水平的变化。该研究发现的候选生物标志物可用于检测AmB制剂诱导的肾损伤的发病和严重程度。

4.4疟原虫 感染恶性疟原虫对人类的代谢状态具有严重和潜在的致命后果。每年约有300万人死于疟疾[46]，世界各大科研机构都会投入大量的基金研究疟原虫，代谢组学技术研究是重要的研究方法之一。Sengupta等[47]使用基于1H NMR的代谢组学技术在非致死性的伯氏疟原虫感染小鼠后，在其体内建立自清除疟疾模型，结果显示在寄生虫血症峰值以及寄生虫感染后清除三周，未感染和感染的小鼠之间存在不同代谢状态；而且在峰值感染和恢复的反应表现出不同的性别差异；观察到乙酰胆碱在两种性别的大脑代谢分布中的积累，这可能对了解疟疾后神经综合征的病理生理学有着重要的暗示作用。Olszewski等[48]描述了基于质谱的代谢组学分析的寄生虫在红细胞48h内发育周期变化情况，结果显示许多代谢物与发育周期有着对应变化，表明了寄生虫对系统精氨酸消耗可能是人类疟疾低精氨酸血症与脑疟疾发病相关的一个重要因素。Li等[49]使用高分辨率1H NMR光谱和多变量数据分析技术表征小鼠感染伯氏疟原虫后的代谢变化，结果发现糖酵解上调和伯氏疟原虫感染的能量需求增加有关。还发现了伯氏疟原虫感染小鼠后尿中出现了卵清酸，这表明代谢谱可提供疟原虫感染的诊断工具。

5 结 语

代谢组学目前主要应用于药物研发、疾病监测等领域，经多年的研究探索，研究方法逐渐趋于成熟。但代谢组学研究中依然有很多技术有待优化，例如将大型仪器的小型化，使其更方便快捷，解决方法学需要进一步的标准化和程序化，代谢产物数据库也需要进一步完善等。

在重要寄生原虫代谢组学的研究方面，对寄生原虫与药物作用的代谢组学分析、寄生原虫感染宿主的代谢反应、生物诊断标志物的鉴定以及宿主与寄生原虫之间相互作用，已经有比较深入的研究。但从整体来看寄生原虫代谢组学的相关研究较少，而且涉及范围较窄，研究的寄生原虫较多的是本文综述的四种与公共卫生紧密相关的寄生原虫。

相信随着代谢组学技术的逐渐成熟以及新的分析方法的逐步建立，寄生虫代谢组学的研究会更加深入，研究范围也会进一步加大，研究的寄生虫也不再局限于只对公共卫生息息相关的寄生虫，而对畜牧业生产影响较大的寄生虫，比如：球虫、蠕虫等及其感染宿主的代谢组学研究必将得到加强。

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