2014-2015年商洛市流感病毒H3N2亚型血凝素(HA1)基因进化研究

， ，，，，，

流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒，自流感被发现以来，每年在全球范围内都有季节性流行[1]，流感病毒的基因分子进化及疫苗研究一直是各地学者研究的热点。流感H3N2亚型在流感暴发流行历史中扮演重要角色，其一直在人群中流行传播，并发生变异。流感病毒的抗原性变异主要指血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原结构的改变，其中以HA最为重要，变异也最为显著[2]，世界卫生组织(WHO)推出疫苗株也一再更新。从近几年全球的流行病学调查分析可以看出，H3N2亚型在大多数国家是流感流行的优势毒株，我国也以甲型H3N2病毒为优势株。仅1968-1992年间我国发生的10次流感，其中就有7次都是由H3N2亚型流感病毒所引起[3]。商洛市对流感研究起步较晚，开始于2009年流感疫情再次席卷全球。本课题依托中国流感监测信息系统平台，收集2014-2015年商洛市国家流感网络实验室流感H3N2亚型毒株，了解商洛市流感病毒进化规律，以及流行趋势，与WHO推荐标准疫苗株及国内毒株进行比对，研究流行株与疫苗匹配性，为当地流感高危人群选择性预防接种工作提供参考，对减少发病率，减轻公共卫生预防控制工作负担有重要意义。

1 材料与方法

1.1研究对象 根据《全国流感监测技术指南(2010年版)》(下文简称《指南》)，收集流感监测哨点医院商洛市中心医院流感样病例(influenza-like illness, ILI)，ILI是指发热(体温大于等于38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者，同时缺乏其他实验室诊断依据。用病毒采样管(友康)2～8 ℃冷藏保存，12 h内送商洛市疾病预防控制中心国家流感监测实验室。

1.2仪器与试剂 全自动核酸提取仪(西安天隆NP968)；全自动荧光定量PCR检测系统(上海宏石SLAN-96P)；PCR仪(美国Bio-Rad PTC-200)；电泳仪(北京六一DYY-2C)；凝胶成像仪(海南黑马GSG-2000)。核酸提取由西安天隆提供配套商品试剂盒；实时荧光PCR(Real-time PCR)A、B及H3亚型分型采用上海之江商品试剂盒；MDCK细胞由陕西省疾病预防控制中心提供；鉴定血清由中国疾病预防控制中心国家流感中心提供；PCR使用QIAGEN公司One Step RT-PCR Kit试剂盒。

1.3 方法

1.3.1核酸检测 对流感哨点医院ILI标本用全自动核酸提取仪提取核酸(按产品说明书操作)，用上海之江核酸检测试剂对核酸提取物进行Real-time PCR检测(按产品说明书操作)。

1.3.2病毒分离培养 将核酸检测阳性标本用单层狗肾传代细胞(MDCK)进行分离培养，收集细胞病变(CPE)“+++”～“++++”的样本，用豚鼠血球或火鸡血球进行血凝试验(HA)，阳性毒株(HA>1∶8)用血凝抑制试验(HI)进行鉴定分型。

1.3.3序列测定 将鉴定为H3标本病毒培养液用全自动核酸提取仪提取核酸，具体操作见说明书；提取核酸进行RT-PCR扩增，引物设计及合成由上海之江生物公司提供(引物合成自Thermo Fisher)，引物序列见表1；PCR后，用1%琼脂糖凝胶电泳；阳性条带送上海美吉生物医学有限公司测序。

表1 引物核苷酸序列
Tab.1 The nucleotide sequence of the primer

PrimerSequenceTmLength/bpYF⁃HA⁃H3⁃35′⁃ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGC⁃3′59768YF⁃HA⁃H3⁃95′⁃TCCCGGTTTTACTATTGTCCA⁃3′59．3YF⁃HA⁃H3⁃55′⁃TCAAAAYGGAACAAGCTCTGC⁃3′60．4676YF⁃HA⁃H3⁃65′⁃TTGATGCCTGAAACCGTACC⁃3′60．9YF⁃HA⁃H3⁃75′⁃TGAAATTGGCAACAGGGAT⁃3′58．9714YF⁃HA⁃H3⁃85′⁃CTCAAATGCAAATGTTGCAC⁃3′57．8

1.3.4序列分析 将所得的测序结果应用clustax2.1软件进行序列比对后，应用Mega 6.0软件，构建系统发育进化树，系统进化树采用Neighboring-joining方法及Kimura-2-Parameter模式进行绘制，Bootstrap值进行1 000次重复运算。以WHO推荐2014-2015年H3N2标准疫苗株A/Texas/50/2012[4]为对照进行氨基酸变异分析。

2 结 果

2.1HA1片段的序列分析与同源性分析 本研究得到毒株的HA1序列为987 bp，编码329个氨基酸。以A/HongKong/1/1968的HA1基因为基准，对分离H3N2毒株HA1基因构建核苷酸序列进化树，见图1。季节性H3N2的HA1基因在不断变异，进化基本按时间顺序逐渐演变，但2014-2015年在进化树上有交替过渡出现。2014-2015年分离毒株同源性在97.2%～99.9%，分离毒株与2014-2015年标准疫苗株A/Texas/50/2012同源性为97.3%～98.5%(表2)。

表2 流感H3N2基因HA1同源性分析
Tab.2 Analysis homology of the HA1 genes of influenza A(H3N2)

2.2H3N2亚型流感病毒HA1特异性分析 2014年商洛市分离的H3N2毒株与2014-2015年推荐疫苗株A/Texas/50/2012相比，其HA1亚基氨基酸变异点主要有I3L、T128N、Y159F、K171N、S198P、I312K、E322G；2015年商洛市分离的H3N2毒株与2014-2015年的疫苗株A/Texas/50/2012(H3N2)相比，其HA1亚基氨基酸变异点主要有N124S、A128N、S138A、G142R、S159F、S198P、G223E、E260K、T313A、E322G、D327N，见表3。

表3 流感H3N2亚型HA1基因氨基酸变异分析
Tab.3 Amino acid variation of HA1 nucleotide of influenza A(H3N2)

StrainsAminoacidvariationsites3124128138142159171198223260312313322327A/Texas/50/2012＿VaccineLSNARFNPEKKAGNA/ShangLuo/06/2014--T--Y-S--I-E-A/ShangLuo/173/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/182/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/244/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/04/2015-NASGS-SGE-TEDA/ShangLuo/15/2015-NASGS-SGE-TEDA/ShangLuo/30/2015-NASGS-SGE-TED

2.3HA1潜在糖基化位点 HA蛋白在细胞转移中进行糖基化加工修饰，H3N2HA蛋白至少有7个N糖基化位点，其中6个位于HA1，其序列为N-X-T/S(N-天冬氨酸,T-苏氨酸,S-丝氨酸,X-任意氨基酸)。HA1分子含有大量的糖类，大部分位于氨基酸的末端，其位点增加或减少对流感病毒的抗原性及其他生物学特性均有一定影响[5]。用在线糖基化预测分析潜在的糖基化位点[6]。2014-2015年商洛市分离毒株的HA1的氨基酸与疫苗株A/Texas/50/2012相比糖基化位点没有变化。

2.4二硫键的变化 流感病毒HA蛋白分子上有6个二硫键，其中5个位于HA1区，包括HA1第14位的半胱氨酸与HA2第137位的半胱氨酸之间形成的将HA1和HA2相连的二硫键；其余4个二硫键分别为HA1的52与277、62 与67、97 与139、281 与305的半胱氨酸之间形成的二硫键[7-9]。本次研究分析中2014-2015年度商洛市的流感毒株的HA1区5个二硫键均未发现氨基酸替换、缺失和插入。

3 讨 论

2009年以来，商洛市流感病毒流行株主要在A型H1N1(2009)、季节性H1、H3N2及B型Yamagata、Victoria亚型之间交替出现，当流感出现一种新的亚型，由于人群缺乏特异性的免疫，人类普遍易感。商洛市位于北方片区，属于暖温带半湿润季风山地气候，流感流行季节明显，流行高峰一般会在每年11月到次年3月份左右，夏秋季流感病例很少检出。从2012-2015年，流感H3N2亚型逐渐增多并成为北方地区优势毒株流行株[10-11]，其主要原因：一是流感变异速率快、幅度大，容易逃脱宿主的识别和清除，缺乏依赖RNA的RNA聚合酶的校正作用，导致毒株变异；二是受人群免疫力自然选择的压力。本研究中流感H3N2亚型HA1基因进化树沿主干随时间逐渐向上延伸，其分支较短，提示毒株变异很快，且2014-2015年毒株有交替出现。从进化树可以看到2014年毒株与疫苗株A/Texas/50/2012距离较近，而2015年毒株则与疫苗株A/Texas/50/2012较远，说明商洛市H3N2毒株受到的人群免疫力较大。

流感病毒的HA蛋白以三聚体(trimer)的形式存在于双层类脂膜上，由3个非共价结合的HA蛋白单体所组成。HA蛋白三聚体可分为呈杆状的基底部及呈球状的头部，HA1主要组成其头部。病毒受体结合位点(RBS)位于HA头部，呈浅袋状，其中98Y、153 W、155T、183H、190E和194L的氨基酸残基组成口袋装的表面；224位～228位和134位～138位这2个区域分别构成受体结合部位的左右缘[12]。大部分流感病毒株HA1的5个氨基酸(98、153、183、190 和 194)是高度保守的，不参与RBS位点与受体结合，可能对稳定RBS结构、促进病毒与受体结合和病毒繁殖等生理功能起到重要的作用[13-14]。2015年商洛市分离毒株发生S138A变异，提示病毒结合位点空间结构有可能改变，应当引起重视，这与罗鹏飞[15]等人研究结果相同。此外RBS的某些结构组成部分结构及其位点发生了变异，说明这些RBS结构组成部分可能同时作为抗原抗体的相互作用位点，宿主的细胞免疫可能参与了对抗流感病毒的过程[16]。

X线晶体结构研究发现，H3N2亚型流感病毒HA蛋白上的抗原决定簇分为5个区, A 区包括133～137位和140～146位形成的突出的环上, B区位于155位上的主环156～160位及球区末端围绕着α 螺旋结构的187～198位。C区位于球区下方的 53、54、275、278位, 由52位和277位的形成的膨胀部分所在区。D区由207位和174位组成。E区由63、78 、81、83位组成[17]。流感HA1氨基酸在快速、持续不断的发生突变，但主要是以嘌呤A/G或嘧啶C/T互换最为常见，嘌呤与嘧啶间的置换较少。近几年，由于很难获得鸡胚分离的H3N2亚型流感病毒，且H3N2亚型流感病毒在鸡胚分离时抗原决定簇发生适应性突变，因此WHO推荐使用A/Texas/50/2012-likevirus作为疫苗组分[18-19]。2014-2015年商洛市分离H3N2毒株与WHO推荐疫苗株HA1基因氨基酸比较，2014年其主要抗原决定簇氨基酸变异点有B区Y159F、S198P；2015年主要抗原决定簇氨基酸变异点有A区G142R，B区S159F、S198P，马萍[20]等在陕西省2011-2013年H3N2流感流行趋势分析中发现2011-2012年抗原变异有B区S198A位,2012-2013年抗原变异位点有A区G142R，李希妍[21]等对2013-2014年中国H3N2亚型研究发现HA基因序列也有G142R、S198P位点变异。流感病毒在细胞培养或鸡胚分离传代中会产生序列变异，但结合本地区流感H3N2亚型流行株与中国疾病预防控制中心上述相关研究，A/Texas/50/2012疫苗株已连续使用两年，而且对流行株与疫苗株抗原决定簇氨基酸比较，发现已经产生多位点突变，这可能会导致病毒抗原性发生较大改变。因此应该及时对我国流感H3N2亚型疫苗组分进行更新。

综上所述，2014-2015商洛市流感监测年度流感流行株以H3N2为主，且WHO推荐疫苗株组分匹配性已不是最佳，急需更新，其主要原因可能受环境因素及人群活动影响，与本地区经济不发达，人群流感疫苗接种率普遍偏低，病毒抗原的不断变异，病毒逃避免疫等机制相关。因此对流感抗原变异情况及时监测分析，对预测流感流行情况、疫苗匹配性及筛选有重要意义和参考价值。

[1] Zhou Y,Li YF,Chen J, et al. Drug resistance surveillance of influenza A( H3N2) virus children in Shanghai[J]. Chin J Health Lab Tec, 2014, 24(11): 1536-1539. (in Chinese)

周妍,李月芳,陈健,等. 2009-2012年上海地区儿童甲型H3N2流感病毒的耐药性监测[J].中国卫生检验杂志,2014,24(11):1536-1539.

[2] Huang P, Zhong J, Liang LJ, et al. Molecular evolution of human influenza H3N2 virus hemagglutinin genes in Guangdong China[J]. Chin J Virol, 2012, 28(04): 330-335. DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002286 (in Chinese)

黄平,钟静,梁丽君,等.广东地区流感H3N2毒株血凝素基因特征、进化和变异分析[J].病毒学报,2012,28(04):330-335.

[3] Guo YJ, Dong ZY, Zhang SL, et al. Influenza activity in human population in China since 1968[J]. Chin J Exp Clin Virol, 1933, 7(3): 237-241. (in Chinese)

郭元吉,董振英,张莎林,等.1968年以来流行性感冒在我国人群中活动的概况[J].中华实验和临床病毒学杂志,1933,7(3):237-241.

[4] Yue CY, An ZJ. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2014-2015 northern hemisphere influenza season[J]. Chin Vac Immun, 2014, 20(05): 388. (in Chinese)

岳晨妍,安志杰.世界卫生组织关于2014-2015年北半球流行性感冒流行季节流行性感冒疫苗推荐组成成分的建议[J].中国疫苗和免疫,2014,20(05):388.

[5] Schulze IT. Effects of glycosylation on the properties and functions of influenza virus hemagglutinin[J]. J Infect Dis, 1997, 176(Suppl1): S24-S28. DOI: 10.1086/514170

[6] CBS. NetNGlyc 1.0 Server [EB/OL]. [2016-12-07]. http: //www.Cbs.Dtu.dk/services/NetNGlyc/

[7] Baker AT, Varghese JN, Laver WG, et al. Three-dimensional structure of neuraminidase of subtype N9 from an avian influenza virus[J]. Protein: Structure, Function, and Genetics, 1987, 2(2): 111-117. DOI:10.1002/prot.340020205

[8] Ji Q. Medical molecular virology[M]. Beijing: Science Press, 2001. (in Chinese)

金奇.医学分子病毒学[M].北京:科学出版社,2001.

[9] Hong T. Viral medicine basic theory and experimental techniques[M]. Beijing: Science Press, 1990. (in Chinese)

洪涛.医学病毒性基础理论及其实验技术[M].北京:科学出版社,1990.

[10] Huang WJ, Cheng YH, Li XY, et al. Virological characterization of influenza A(H3N2) virus in mainland China during 2011-2012[J]. Chin J Virol, 2013, 29(03): 258-264. (in Chinese)

黄维娟,成艳辉,李希妍,等. 2011-2012年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析[J]. 病毒学报, 2013,29 (03):258-264.

[11] Ma P, Xu J, Zhang L, et al. Study on the epidemical trend and genetic(HA1) characteristics of influenza H3N2 virus in Shaanxi province from 2011 to 2013[J]. Chin J Health Lab Tec, 2015, 25(20): 3413-3415. (in Chinese)

马萍,许晶,张蕾,等. 陕西省2011-2013年H3N2流感流行趋势及HA1基因特征研究[J]. 中国卫生检验杂志,2015,25(20):3413-3415.

[12] Ding X, Jing L, Ke C, et al. Amino acid sequence analysis and identification of mutations under positive selection in hemagglutinin of 2009 influenza A(H1N1) isolates[J]. Virus Genes, 2010, 41(3): 329-340. DOI: 10.1007/s11262-010-0526-z

[13] Lee PS, Yoshida R, Ekiert DC, et al. Heterosubtypic antibody recognition of the influenza virus hemagglutinin receptor binding site enhanced by avidity[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(42): 17040-17045. DOI: 10.1073/pnas.1212371109

[14] Xie JF, Shen XN, Wang MA, et al. Analysis of the hemagglutinin gene characteristics of H3N2 subtype influenza viruses isolated in Fujian.2010-2012[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 29(12): 1157-1161. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2013.12.006 (in Chinese)

谢剑锋,沈晓娜,王美爱,等.2010-2012年福建省H3N2亚型流感病毒血凝素基因特征分析[J].中国人兽共患病学报,2012,29(12):1157-1161.

[15] Luo PF, Cao S, Li W, et al. Molecular genetic characteristics of surface protein genes of globe seasonal H3N2influenza virus in 2010-2011[J]. Microbio China, 2012, 39(07): 971-979. DOI: 10.13344/j.microbiol.China.2012.07.009 (in Chinese)

罗鹏飞,曹尚,李伟,等. 2010-2011年全球季节性H3N2流感病毒表面蛋白基因的分子遗传特性分析[J]. 微生物学通报,2012,39(07):971-979.

[16] Wang Y, Xue Y, Chen SX, et al. Analysis and studies on the amino acid sequence homology, mutant regularity, structural and functional relationship ofHA1 of human influenza virus(H3N2)[J]. Chin J Virol, 2002, 18(04): 289-296. DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.001420 (in Chinese)

王勇,薛颖,陈淑霞,等. H3N2亚型人流行性感冒病毒HA1的蛋白序列同源性比较、变异规律及结构与功能的分析[J].病毒学报,2002,18(04):289-296.

[17] Falchi A, Amoros JP, Arena C, et al. Genetic structure of human A/H1N1 and A/H3N2 influenza virus on Corsica Island: phyloge-netic analysis and vaccine strain match, 2006-2010[J]. PLoS One, 2011, 6(9): e24471. DOI: 10.1371/journal.pone.0024471

[18] Li XY, Cheng YH, Tan MJ, et al. Virological characteristics of influenza A(H3N2) virus in mainland China during 2013-2014[J]. Chin J Virol, 2015, 31(01): 30-35. DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002622 (in Chinese)

李希妍,成艳辉,谭敏菊,等. 2013-2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析[J]. 病毒学报,2015,31(01):30-35.

[19] WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2014-2015 northern hemisphere influenza season[EB/OL]．[2014-2-20]. http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2014_15_north/en/

[20] Ma P, Xu J, Zhang L, et al. Study on the epidemical trend and genetic(HA1) characteristics of influenza H3N2 virus in Shaanxi province from 2011 to 2013[J]. Chin J Health Lab Tech, 2015, 25(20): 3413-3415. (in Chinese)

马萍,许晶,张蕾,等. 陕西省2011-2013年H3N2流感流行趋势及HA1基因特征研究[J].中国卫生检验杂 志,2015,25(20):3413-3415.

[21] Li XY, Cheng YH, Tan MJ, et al. Virological characteristics of influenza A(H3N2) virus in mainland China during 2013-2014[J]. Chin J Virol, 2015, 31(01): 30-35. DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002622 (in Chinese)

李希妍,成艳辉,谭敏菊,等. 2013-2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析[J]. 病毒学报,2015,31(01):30-35.