雪上一支蒿的化学成分研究

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1.保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000；2. 云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500

毛茛科乌头属(Aconitum)植物约有350种，主要分布于亚洲。《中国植物志》记载我国约有167种，大多数分布于云南北部、四川西部和西藏东部的高山地带[1]。目前已经有40余种乌头属植物当作药物使用[2]，从乌头属植物中开发了草乌甲素、高乌甲素、3-乙酰乌头碱等药品应用于临床。雪上一支蒿来源于毛茛科乌头属植物短柄乌头AconitumbrachypodumDiels.块根，是云、贵、川等地区广泛使用的民间用药，尤其是在云南应用较为普遍，主产于云南北部的东川、会泽等地，具有祛风镇痛的功效，用于治疗风湿疼痛、跌打损伤等症[3]。1974年版《云南省药品标准》和1977年版《中国药典》一部曾经收载。以雪上一枝蒿为原料开发的药品如雪上一枝蒿总碱片、雪上一枝蒿总碱注射剂、骨痛灵酊以及搽剂、气雾剂等制剂已经用于临床[4-6]，主要用于治疗风湿疼痛、关节炎等疾病。但雪上一枝蒿化学成份研究报道较少，目前认为二萜生物碱是其主要成分[7-9]；为了进一步认识其物质基础，课题组开展了雪上一枝蒿的化学成分研究；从雪上一枝蒿乙醇提取物中分离鉴定了11个化合物，其中8个二萜生物碱，2个甾体类化合物，1个神经酰胺。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Yanaco显微熔点仪；Autospec-3000质谱仪；AM-400或DRX-500型核磁共振波谱仪。

1.2 材料柱色谱所用硅胶(200～300目)、薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工厂、烟台大学生物科学与工程研究所)；柱层析氧化铝(100～200目)(上海陆都化学试剂厂)；葡聚糖凝胶LH-20(Pharmacia公司)。层析用试剂甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、环己烷等试剂均用重蒸工业级；二乙胺为分析纯；实验用水为反渗透滤纯化水；萃取氯仿为普通工业级；再结晶用试剂为重蒸工业级试剂。显色剂采用10%的硫酸乙醇溶液，改良碘化铋钾溶液。

雪上一支蒿购于云南省东川地区，经云南中医学院中药鉴定教研室杨竹雅副教授鉴定为毛茛科乌头属短柄乌头(AconitumbrachypodumDiels.)的块根。

2 提取与分离

干燥的雪上一支蒿药材(30kg)粉碎后以95%的乙醇回流提取3次，回收溶剂得棕色浸膏，浸膏用3.6%的盐酸溶液反复捏溶过滤，滤液合并后用氨水(25%)调pH至9～10，用氯仿多次萃取，合并氯仿萃取液，回收溶剂得总生物碱膏(393g)。

总生物碱膏利用氧化铝柱色谱(100～200目)分离，以石油醚-丙酮-二乙胺(20∶1∶1～3∶1∶1)溶系统梯度洗脱，经TLC检查合并为7个组分(Fr.A-Fr.G)。

Fr.A组分利用硅胶柱色谱(200～300目)层析，以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(30∶1∶1～5∶1∶1)溶剂系统梯度洗脱，经TLC检查合后合并为3个流分段A-1～3。其中A-1流份用氧化铝色谱分离，石油醚-乙酸乙酯-二乙胺(20∶1∶1～5∶1∶1)溶剂系统洗脱，丙酮重结晶，得化合物5(15.5g)。A-3流分利用硅胶柱色谱分离以环己烷-丙酮(10∶1～4∶1)梯度洗脱，再用氯仿重结晶，得化合物9(3.1g)

FrB部分以石油醚-丙酮(1 ∶ 1)为洗脱剂经氧化铝柱层析、色点相同的部分合并为4部分B1～4；B1部分经硅胶柱层析及SephadexLH-20柱层析(CHCl3/MeOH, 1∶1)，得化合物1(14mg)；B2流分利用氧化铝色谱以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(10∶1∶1～5∶1∶1)梯度洗脱后经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱(甲醇)纯化，再用丙酮重结晶得化合物7(33mg)；B3流分用环己烷-丙酮-二乙胺(15∶1∶1～10∶1∶1)溶剂系统进行硅胶柱色谱分离，用环己烷-乙酸乙酯(12∶1～8∶1)溶剂系统反复进行中性氧化铝柱色谱纯化，再用丙酮重结晶，得化合物3(20mg)和8(76mg)；B4流分用环己烷-丙酮-二乙胺(10∶1∶1～8∶1∶1)溶剂系统反复进行硅胶柱色谱层析，再用丙酮重结晶得化合物6(26mg)。

Fr.C组分用利用硅胶柱色谱，以氯仿-丙酮系统梯度(40∶1～20∶1)洗脱，经TLC检查后合为3个流分段C1～3。其中C-1流分用丙酮重结晶得到化合物4(25mg)；C-2流分用环己烷-丙酮-二乙胺(8∶1∶0.1～5∶1∶0.1)溶剂系统反复进行硅胶柱色谱，再用丙酮重结晶，得化合物11(54mg)。

Fr.D组分利用利用氧化铝色谱，以环己烷-乙酸乙酯系统(30∶1～5∶1)梯度洗脱，经TLC检查合并，划分为3个流份B-1～3。其中B-1流份经反复硅胶柱层析及葡聚糖凝胶LH-20柱色谱纯化，得化合物2(87mg)。B2流分用氯仿-甲醇系统梯度(20∶1～9∶1)系统进行硅胶柱色谱分离，再用甲醇重结晶，得化合物10(37 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定型粉末,碘化铋钾反应呈阳性,分子式:C22H33O2N。1H-NMR(400 MHz, C5H5N)δ:6.63(1H, d,J= 6.4 Hz, OH-11), 5.77(1H, br.s, OH-15), 5.30(1H, dd,J= 2.3, 2.0 Hz, αH-17), 4.68(1H, dd,J= 2.4, 1.8 Hz, βH-17), 4.09(1H, dd,J= 6.7, 4.6 Hz, H-15), 3.46(1H, br.s, H-20), 3.39(1H, dd,J= 7.9, 5.6 Hz, H-11), 1.19(1H, d,J= 6.9 Hz, H-5), 1.06(3H, d,J= 7.1 Hz, NCH2CH3), 0.63(3H, s, H-18); 13C-NMR (100 MHz, C5H5N) δ:40.8(C-1), 23.5(C-2), 28.7(C-3), 34.2(C-4), 52.9(C-5), 21.3(C-6), 42.9(C-7), 46.1(C-8), 54.1(C-9), 44.4(C-10), 72.7(C-11), 48.5(C-12), 25.3(C-13), 27.2(C-14), 78.3(C-15), 155.8(C-16), 109.5(C-17), 26.9(C-18), 57.8(C-19), 72.5(C-20), 51.1(NCH2CH3), 14.1(NCH2CH3);1H-NMR和13C-NMR数据与文献[10]报道一致，鉴定为雪上一支蒿甲素。

化合物2：白色粉末，分子式:C22H29O3N。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ:5.31(1H, br.s, αH-17), 5.20(1H, br.s, βH-17), 4.40(1H, d,J= 2.6 Hz, H-15), 3.98(1H, d,J= 5.2 Hz, H-1), 3.81(1H, br.s, H-19), 3.15(1H, d,J= 2.6 Hz, H-13), 2.84(3H, s, H-20), 1.56(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5), 1.03(3H, d,J= 7.2 Hz, NCH2CH3), 0.84(3H, s, H-18)；13C-NMR(100 MHz, C5D5N):67.6(C-1), 30.0(C-2), 24.1(C-3), 37.7(C-4), 48.5(C-5), 24.1(C-6), 46.0(C-7), 50.0(C-8), 31.2(C-9), 51.9(C-10), 30.1(C-11), 208.4(C-12), 53.6(C-13), 37.5(C-14), 76.8(C-15), 149.6(C-16), 111.0(C-17), 18.9(C-18), 92.8(C-19), 66.4(C-20), 48.5(NCH2CH3), 14.3(NCH2CH3);1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道[11]一致，鉴定为songoramine。

化合物3：白色颗粒(丙酮)，分子式：C32H41O10N。1H-NMR (400 MHz, C5D5N)δ:8.01(1H, s, N-CHO), 7.99(2H, brd,J= 7.3 Hz, OBz-2′, 6′), 7.31(1H, brt,J= 7.8 Hz, OBz-4′), 7.30(2H, brt,J= 7.3 Hz, OBz-3′, 5′), 4.92(1H, d,J= 5.8 Hz, H-14), 4.69 (1H，brd,J=3.6 Hz, H-3), 4.25(1H, d,J= 4.8 Hz, H-15), 4.19(1H, d,J= 7.2 Hz, H-6), 4.01(1H, brs, H-17), 3.98(1H, d,J=7.5 Hz, H-19), 3.84(1H, d,J= 8.8 Hz, H-18), 3.80(3H, s, 16-OCH3), 3.47(1H, d,J=4.8 Hz, H-16), 3.09(3H, s, 18-OCH3), 3.07(3H, s, 6-OCH3), 3.04(1H, brd,J= 7.2 Hz, H-1), 3.02(3H, s, 1-OCH3), 5.05(1H, d,J= 8.8 Hz, H-18), 2.98(1H, d,J= 7.5 Hz, H-19), 2.94(1H, d,J= 14.2 Hz, H-12α), 2.85(1H, t,J= 5.8 Hz, H-9), 2.77(1H, brs, H-7), 2.40(1H, d,J=7.2 Hz, H-5), 2.38(1H, dd,J= 12.8, 7.2 Hz, H-2β), 2.17(1H, m, H-10), 2.17(1H, d,J= 14.2 Hz, H-12β), 2.08(3H, s, 3-Ac), 1.38(1H, d,J= 12 8, 3.6 Hz, H-2α), 1.35(3H, s, 8-Ac);13C-NMR (100 MHz, C5D5N):79.5(C-1), 31.3(C-2), 70.8(C-3), 41.3(C-4), 46.9(C-5), 83.1(C-6), 51.6(C-7), 92.1(C-8), 43.8(C-9), 40.4(C-10), 48.6(C-11), 35.7(C-12), 75.1(C-13), 79.1(C-14), 79.2(C-15), 90.5(C-16), 57.5(C-17), 71.6(C-18), 39.3(C-19), 58.6(18-OCH3), 61.3(16-OCH3), 57.9(6-OCH3), 55.2(1-OCH3), 20.6(3-CH3C=O), 21.1(8-CH3C=O), 171.8(8-CH3C=O), 169.7(3-CH3C=O), 166.0(C-7′), 129.7(C-1′), 129.7(C-2′, 6′), 133.4(C-4′), 128.7(C-3′, 5′), 162.7(N-CHO);1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道[9]一致，鉴定为brachyaconitineA。

化合物4：白色无定型粉末(丙酮)，分子式：C32H41O10N。1HNMR(400 MHz, C5D5N)δ:8.15(2H, brd,J=7.3 Hz, OBz-2′, 6′), 7.39(1H, brt,J= 7.8 Hz, OBz-4′), 7.29(2H, brt,J= 7.3 Hz, OBz-3′, 5′), 4.94(1H, d,J= 5.8 Hz, H-14), 4.68(1H，brd,J= 3.6 Hz, H-3), 4.65(1H, d,J= 4.8 Hz, H-15), 4.11(1H, d,J= 7.2 Hz, H-6), 8.15(1H, brs, H-17), 2.31-2.43(1H, d,J= 7.5 Hz, H-19), 2.94(1H, d,J= 8.8 Hz, H-18), 3.24(3H, s, 16-OCH3), 3.28(1H, d,J= 4.8 Hz, H-16), 3.76(3H, s, 18-OCH3), 3.24(3H, s, 6-OCH3), 3.04(1H, brd,J= 7.2 Hz, H-1), 3.12(3H, s, 1-OCH3), 4.02(1H, d,J= 8.8 Hz, H-18), 2.77-2.83(1H, d,J= 7.5 Hz, H-19), 2,46(1H, d,J= 14.2Hz, H-12α), 2.26-2.33(1H, t,J= 5.8 Hz, H-9), 5.68(1H, brs, H-7), 2.10(1H, d,J= 7.2 Hz, H-5), 2.31(1H, dd,J= 12.8, 7.2 Hz, H-2β), 2.46-2.57(1H, m, H-10), 2.46-2.57(1H, d,J= 14.2 Hz, H-12β), 1.98(3H, s, 3-Ac), 1.19(1H, d,J= 12.8, 3.6 Hz, H-2α);13C-NMR(100MHz, C5D5N):80.3(C-1), 30.3(C-2), 72.1(C-3), 47.1(C-4), 42.5(C-5), 86.9(C-6), 130.4(C-7), 138.1(C-8), 40.3(C-9), 41.5(C-10), 42.5(C-11), 40.3(C-12), 76.6(C-13), 80.3(C-14), 73.1(C-15), 94.0(C-16), 72.1(C-18), 52.7(C-19), 57.4(1-OCH3), 58.5(6-OCH3), 61.8(16-OCH3), 163.9(C-17), 61.8(18-OCH3), 20.8(3-CH3C=O) 169.8(3-CH3C=O), 166.2(C-7′), 133.0(C-4′), 129.9(C-1′), 130.3(C-2′, 6′), 128.4(C-3′, 5′);1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道[9]一致，鉴定为brachyaconitineB。

化合物5：白色块状结晶, 分子式：C22H31O3N;1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:5.20(1H, br.s, αH-17), 5.19(1H, br.s, βH-17), 4.31(1H, br.s, H-15), 3.82(1H, dd, J= 8.0, 7.6 Hz, H-1), 3.50(3H, s, H-20), 3.31(1H, t,J= 4.0 Hz), 2.46(1H, dd,J= 18.6, 13.4Hz, βH -11), 3.03(1H, s, H-13), 2.16(1H, d,J= 12.5Hz, H-7), 1.32(1H, d,J= 8.3 Hz, H -5), 1.06(3H, d,J=8.3 Hz, NCH2CH3), 0.76(3H, s, H-18);13C-NMR (100 MHz， CDCl3) δ:71.9 (C-1), 32.5 (C-2), 32.6 (C-3), 35.4 (C-4), 51.3(C-5), 23.7(C-6), 45.3(C-7), 53.3(C-8), 36.9(C-9), 50.5(C-10), 39.6(C-11), 213.5(C-12), 55.2(C-13), 39.4(C-14), 78.0(C-15), 151.8(C-16), 111.7(C-17), 26.5(C-18), 58.2(C-19), 67.3(C-20), 52.2(NCH2CH3), 13.8(NCH2CH3);1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道[12]一致,鉴定为松果灵。

化合物6：白色结晶(丙酮)，分子式为C24H33O4N。1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ:5.64(1H, d,J= 1.8 Hz, H-15), 5.24(1H, d,J= 1.2 Hz, αH-17), 4.94(1H, d,J= 1.2 Hz, βH-17), 3.84(1H, dd,J= 8.9, 6.5 H-1), 3.45(3H, s, H-20), 3.09(1H, d,J= 4.1 Hz, H-13), 2.27(1H, d,J= 5.2 Hz, H-7), 2.11(3H, s, OAc-15), 1.31(1H, d,J= 7.6 Hz, H -5), 1.05(3H, d,J= 7.2 Hz, NCH2CH3), 0.75(3H, s, H-18)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3):70.2(C-1), 32.1(C-2), 32.1(C-3), 34.1(C-4), 49.2(C-5), 23.5(C-6), 43.3(C-7), 52.1(C-8), 36.5(C-9), 49.2(C-10), 37.3(C-11), 209.7(C-12), 54.0 (C-13), 37.9(C-14), 77.0(C-15), 145.3(C-16), 112.6(C-17), 26.1(C-18), 57.1(C-19), 65.7(C-20), 50.9(NCH2CH3), 13.6(NCH2CH3), 170.6(OAc-15), 21.5(OAc-15);1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道[13]一致,鉴定为15-乙酰松果灵(15-actylsongorine)。

化合物7：白色块状结晶, 分子式为:C22H33O3N；1H-NMR (500 MHz, C5D5N) δ:5.24(1H, br.s, αH-17), 4.92(1H, br.s, βH-17), 4.08(1H, br.s, H-15), 4.14(1H, dd,J= 5.2, 2.6 Hz, H-12), 3.30(3H, s, H-20), 2.98(1H, dd,J= 9.2, 5.3 Hz, H-13), 2.43(1H, d,J= 8.7 Hz, H-7), 1.69(1H, d,J= 15.2 Hz, H-5), 1.28(3H, d,J= 5.4 Hz, NCH2CH3), 0.75 (3H, s, H-18);13C-NMR (125 MHz, C5D5N) δ:67.3(C-1), 26.7(C-2), 31.2(C-3), 35.2(C-4), 51.3(C-5), 24.2(C-6), 45.6(C-7), 40.0(C-8), 45.0(C-9), 52.2(C-10), 31.2(C-11), 71.9(C-12), 49.0(C-13), 35.2(C-14), 78.1(C-15), 154.7(C-16), 112.3(C-17), 25.2(C-18), 58.7(C-19), 69.6(C-20), 52.2(NCH2CH3), 13.7(NCH2CH3);1H-NMR和13C-NMR数据与文献[14]报道一致,鉴定为12-epinapelline。

化合物8：白色无定形粉,分子式为C33H43O12N。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ:1.40 (3H, s, 8-OAc), 3.06, 3.11, 3.33, 3.77 (each 3H, s, 4 × OCH3), 4.69 (1H, d,J= 13.6 Hz, H-14), 7.41～8.26 (5H, m, Ar-H), 8.62 (1H, s, N-COH);13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ:83.6(C-1), 35.4(C-2), 67.4(C-3), 43.1(C-4), 50.0(C-5), 80.5(C-6), 52.2(C-7), 90.9(C-8), 44.2(C-9), 40.9(C-10), 49.0(C-11), 36.2(C-12), 75.4(C-13), 79.9(C-14), 79.4(C-15), 92.4(C-16), 58.3(C-17), 72.5(C-18), 39.1(C-19), 162.9(C-21), 55.4(1-OCH3), 57.9(6-OCH3), 61.6(16-OCH3), 58.7(18-OCH3), 172.1(15-CO-CH3), 21.4(15-CO-CH3), 166.3(Ar-CO), 130.6(C-1′), 130.0(C-2′, C-6′), 129.0(C-3′, C-5′), 133.6(C-4′);1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道[11]一致，鉴定为oxonitine。

化合物9：白色鳞片状晶体(氯仿)，用3个展开系统经TLC薄层色谱展开后用10%硫酸-乙醇显色呈现单一紫红色斑点，为一纯化合物，与β-谷甾醇(β-Sitosterol)对照品经TLC薄层对比，其Rf值和显色情况与斑点形状(色谱行为)一致，鉴定为β-谷甾醇。

化合物10：白色无定形粉末，用3个展开系统展开后用10%硫酸-乙醇显色呈现单一蓝紫色斑点，为一纯化合物，与胡萝卜苷(daucosterol)对照品经TLC薄层对比，其Rf值和显色情况与斑点形状(色谱行为)一致，鉴定为胡萝卜苷。

化合物11：白色粉末，分子式C42H83O5N，mp.123～125℃，FAB (+)-MS m/z:705[M+Na + H]+;1H NMR(400MHz, C5H5N)δ:8.57 (1H, d,J= 8.4 Hz, NH), 5.49 (2H, m, H-12, 13), 5.09 (1H, brs, H-2), 4.59 (1H, m, H-2′), 4.50 (1H, m, H-1), 4.40 (1H, m, H-1), 4.33 (1H, brs, H-3), 4.27 (1H, m, H-4), 0.85(2′CH3);13C NMR(C5D5N):δ:62.0(C-1), 53.0(C-2), 76.8(C-3), 72.5(C-4), 33.8(C-5), 26.8(C-6), 29.5～30.4(C-7 to 10, C-15 to 17), 33.3(C-11), 130.8(C-12), 130.7(C-13), 33.0(C-14), 33.0(C-18), 23.0(C-19), 14.3(C-20);175 .1(C-1′), 73.0(C-2′), 35.7(C-3′), 25.8(C-4′), 29.5～30.4 (C-5′ to 19′), 33.3(C-20′), 23.0(C-21′), 14 .3(C-22′); 以上数据与文献报道[15]数据基本一致鉴定为(2S, 3S, 4R, 12E, 2′R)-2-(2′-羟基二十二碳酰胺基)二十碳-1, 3, 4-三羟基-12-烯。

3 讨论

从雪上一支蒿的生物碱膏分离得到11个单体化合物，结构类型主要为二萜生物碱、甾体、神经酰胺等；在分离得到的单体化合物中，化合物1-8为二萜生物碱，9和10为甾体，11为神经酰胺类化合物。其中化合物6-8和11为首次从雪上一支蒿中分离得到。

神经酰胺是鞘脂类物质的基本结构，是由长链鞘氨醇的氨基和长链脂肪酸的羧基形成的酰胺类化合物，具有重要生物学活性，在多个生理病理过程中发挥重要作用。神经酰胺担任细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的第二信使，参与几种淋巴细胞表面蛋白的信号传递。在大多数炎性细胞中，刺激CD95导致迅速且长时间的神经酰胺生成[16]。外源性神经酰胺增强脂多糖LPS诱导的环加氧酶2表达[17]，抑制MAPK激活，抑制PMA和TNF-α诱导的中性白细胞释放超氧化物，抑制磷酸酶D的活性，从而减少中性粒细胞炎症反应。而雪上一枝蒿在各民族民间主要用来治疗类风湿性关节炎，这些化学成分与其用于治疗炎症的用法是否有相关性仍需进一步探讨。研究丰富了雪上一枝蒿的化学成分的认识，为探讨雪上一枝蒿用于治疗类风湿性关节炎等研究提供物质基础。