南昌地区无偿捐献者血小板基因频率调查分析

张晓丽，杜忻

血小板抗原（HPA）是由血小板膜糖蛋白携带的一类特异性抗原，是由遗传决定的。HPA的基因频率在不同种族，不同区域中的分布是不同的。在临床血小板输注过程中，如果血小板同种抗原不相匹配，可导致受血者机体产生血小板同种抗体，引起同种免疫血小板减少综合症，输血后紫癜，血小板输注无效等[1]。因此，血站拥有一些血小板同种抗原分型的血小板供者，在临床输血应用中具有重要意义。我们采用PCR-SSP方法，对南昌地区158例无偿血小板捐献者的HPA1-6，9，15共8个抗原系统16个等位基因进行分型，对其基因及基因型频率和不配合率进行统计分析并与不同人群中的分布进行对比，同时建立南昌地区无偿血小板捐献者HPA基因资料库，为解决临床问题打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 标本 南昌市血站收集158例无血缘关系，固定的无偿血小板捐献者血样3ml/人（份），EDTA抗凝。

1.2 仪器设备与试剂 PCR扩增仪（SimpliAmp）；凝胶成像 （G：BOX F3）； 电泳装置 （Dyy-2C）；HPA1-6，9，15等位基因序列特异性引物 （innotrain有效期内使用）Taq酶 （Promega有效期内使用）；DNA提取试剂盒（inno-train有效期内使用）。

1.3 实验方法 血样DNA提取按DNA提取试剂盒说明书操作，HPA分型方法采用PCR-SSP技术。

1.4 PCR 扩增 取 1.5ml的 Eppendof管， 加入水120μl，PCR 反应缓冲液 60μl，然后加入 DNA 样品20μl（浓度大约 50ng/μl）Taq 酶 1.6μl（5unit/μl），将上述混合液在振荡器上彻底混匀20s，取混合液10μl于PCR反应板上，贴好封板膜或盖好PCR管盖，离心机短暂离心，将PCR扩增仪预热到94°C，放入PCR板或PCR管，按94°C 2min 1个循环，94°C 20s，70°C 60s 5 个循环，94°C 20s，65°C 60s 72°C 45s 10 个循环，94°C 20s，61°C 50s 72°C 45s 20个循环，72°C 5min循环参数扩增。

1.5 PCR产物检测 扩增结束后取5μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶内电泳20～25min，全自动凝胶成像系统观察结果，拍照记录。

1.6 统计学分析方法 采用χ2检验对每个HPA系统的等位基因a，b进行H-W平衡检验，3种基因型 aa，ab，bb 的频率为 faa，fab，fbb，令等位基因 a 的频率为p， 等位基因b的频率为q， 则p=faa+，fab，/2，q=，fbb，+，fab/2；aa 基因型期望值为 np2，ab 基因型期望值为2npq，bb基因型期望值为nq2，将观察值（O）与期望值，（C）按公式（O－C）2/C 进行 χ2检验，比较二者之间差异，P＞0.05即表明可以接受基因频率符合H－W遗传平衡定律，血小板随机输注不配合率[2]。 MP=a2（1-a2）+b2（1-b2）=2ab(1-ab)，a，b 分别代表a和b基因频率。见表1、表2。

2 结果

2.1 HPA1-6，9，15等位基因分型结果 以献血码为0150216000198样本为例，图1。

图1 样本0150216000198HPA1-6，9，15基因分型结果

2.2 基因型和等位基因频率分布 通过统计和计算，得到158例血小板无偿捐献者HPA1-6，9，15基因型和等位基因频率。见表1。

2.3 不同地区、不同种族人群HPA基因频率和不配合率比较 见表2。

3 讨论

血小板抗原分为两类：一类是血小板与其他细胞或组织共有的抗原，称为非特异性抗原；另一类是血小板特异性抗原，存在于血小板膜糖蛋白上，是构成血小板膜结构的一部分，即人类血小板抗原，血小板特异性抗原具有遗传多态性。

我们发现南昌地区无偿血小板捐献者HPA-1a，-2a，-4a，-5a，-6a，-9a 是最常见的等位基因，HPA-1a，-9a呈单态性分布。除HPA-3，-15系统外，其余系统均未检出b/b纯合子。HPA-3，-15系统最具多态性，并存在aa，ab，bb3种表现型。HPA-1，-4系统南昌与南京、海南相同，都是aa纯合子；HPA-9系统南昌与南京、广州、成都、海南、长沙都是aa纯合子。HPA-2系统南昌与海南相比较，有显著性差异(P<0.05)；其它系统南昌与南京、广州、成都、海南、长沙基因频率比较均无显著性差异（P>0.05)。

表1 158例无偿血小板捐献者HPA1-6，9，15系统基因频率分布（n=158）

南昌与不同国家HPA基因频率比较：HPA-1，-2，-5基因频率与美国黑人比较有显著性差异；HPA-1，-5与英国白人有显著性差异；与日本无显著性差异。

在随机血小板输注中，HPAa/b抗原不配合几率的高低，反映了HPA抗原在输血治疗时刺激宿主免疫系统产生血小板同种抗体几率的大小，即HPA不配合率比例越高，产生同种抗体的机会越多，血小板输注时要重视系统的配合。血站建立血小板供者库存，临床对受者进行HPA分型，对提高血小板的输注效果具有重要意义。

在不配合率中可见，南京HPA-2系统较国内其它地区高，MP为0.1388，其它地区均小于0.1，南昌地区HPA-3和HPA-15系统的不配合率分别为0.3714和0.3749，近年来的国内外研究资料表明，HPA-3和HPA-15系统为引起血小板同种免疫的常见系统之一[4，9-12]。

HPA-1，-2，-5系统英国白人和美国黑人的不配合率相比于中国人较高 (国内南京HPA-2系统不配合率也高)，日本人中HPA-2，-4，-5系统的不配合率较中国人高，证明不同种族间遗传背景不同，导致有临床意义的HPA系统不配合率高低也不同。

HPA导致的血小板同种免疫与血小板输注无效、输血后紫癜、新生儿同种免疫性血小板紫癜、特发性血小板减少性紫癜疾病相关，血小板输注无效是指患者在输注合适剂量的血小板后没有产生“适当的反应”，即连续两次输注足量随机供者血小板后，没有达到合适的校正血小板计数增加值 （CCI)，临床出血表现亦未见改善。大约30%～85%长期输注血小板的患者，2%～11%会产生HPA抗体[13]；引起血小板输注无效，2.7%由HPA抗体导致[14]。输血后紫癜是指输注血小板后引起急性、暂时性的同种免疫性血小板减少综合症，原因是出现血小板特异性同种抗体。新生儿同种免疫性血小板紫癜是妊娠期间由于母婴间血小板不合，胎儿血小板抗原刺激母体产生相关抗体，通过胎盘进入胎儿体内，导致胎儿和新生儿血小板减少。特发性血小板减少性紫癜是由于患者自身免疫系统失衡，体内产生针对自身血小板相关抗原的抗体，导致血小板大量破坏，引起免疫性血小板减少。针对这些由HPA引起的免疫性疾病患者，需要输血时，最有效的手段就是输注HPA配合的血液成分。因此，血站建立HPA基因资料库非常有必要！

表2 不同区域和不同种族基因频率和不配合率比较[3]-[8]