ABO血型基因测序在正反定型不符血型鉴定中应用

徐晶

ABO血型系统是临床输血领域最为重要的一个血型系统，由于等位基因在遗传过程中伴随的突变现象，导致了所表达血型抗原的复杂性和多样性，呈现出多种变异的型别[1-3]。ABO血型鉴定传统的血清学方法包括正反定型试验、吸收放散试验和唾液血型物质中和抑制试验，近年来基因学方法在ABO疑难血型中应用得到广泛重视。本实验室采用血清学方法和基因测序法对ABO血型正反定型不符病例1例进行血型鉴定，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 患者资料 某患者，男，13岁，因右肘骨折后伴细菌感染入院，欲行手术治疗。术前备血时，发现其ABO血型正定型A型，反定型为AB型。既往体健，无输血史。为明确血型，遂将其血样标本送至我科做进一步鉴定。

1.2 试剂 单克隆抗-A、抗-B（批号20150101）、抗-AB血 清 （批 号 446000）、 抗-H （批 号20150616）、ABO 试剂红细胞（批号 20165319）均为上海血液生物医药有限责任公司生产；人源抗-B血清 （本室自制）；DNA抽提试剂盒（PROMEGA，USA），PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 （MILLIPORE，Ireland），BigDye Terminator v3.1 循 环 测 序 试 剂 盒（Applied Biosystems，USA），ABI9700 型 PCR 仪（美国Applied Biosystems公司）；凝胶电泳仪（Bio-Rad公司），ABI3130XL基因测序分析仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 血型血清学实验 患者的ABO血型正、反定型采用试管法进行；不规则抗体筛选实验分别采用盐水介质、聚凝胺介质、抗人球蛋白介质中进行；采用人源血清进行吸收实验、采用热放散对吸收人源血清的红细胞进行放散；唾液血型物质检测采用中和抑制试验。所有操作按美国血库协会操作手册进行[4]。

1.4 基因组DNA提取 用DNA提取试剂盒抽提患者血样标本的基因组DNA，所有操作均严格按照试剂说明书进行。

1.5 扩增ABO基因外显子6、7和直接测序 参照文献报道的方法进行[5]。

2 结果

2.1 血清学实验 患者的ABO血型正定型为A型，反定型为AB型。4℃增强后，反定型B细胞出现2+的凝集，与抗H反应室温出现2+的凝集反应，4℃增强后为3+（表1）；唾液中检出A、H血型物质；吸收放散实验表明患者红细胞可吸收放散人源抗-A。

2.2 ABO基因第6、7外显子测序 测序结果显示，外显子6 c.261G未发生缺失，c.297A未发生点突变，外显子7存在c.467C>A的杂合点突变（图1）。

3 讨论

自Yamamato F等[6]克隆出ABO基因的cDNA序列以来，ABO血型的鉴定除了常规血清学方法外，逐步有了分子生物学方法作为补充，截止目前，在人类血型基因突变库记载的等位基因已经达到了380个[7]，这充分说明了ABO等位基因丰富的多态性。等位基因序列多态性的存在，导致了ABO血型抗原表达的差异，最终表现为各种亚型。因此，在常规血清学实验检测的基础上，辅以测序等技术有利于精准鉴定ABO亚型。

图1 患者ABO基因第外显子6和7测序结果

本结果中，患者的血清学正、反定型不相符，正定型为A型，反定型则为AB型。唾液中检出A、H血型物质；吸收放散实验表明患者红细胞可吸收放散人源抗-A。综合分析其血清学实验结果，ABO血型应当定型为A型，伴抗体减弱/消失。

测序结果表明，外显子6 c.261G未发生缺失，c.297A未发生点突变，外显子7存在c.467C>A的杂合点突变，对比血型抗原基因突变数据库，该位点为ABO*A102的特异性突变位点，可以得出，该患者的基因型为A102/A101，测序结果与血清学综合分析得出的鉴定结果相符。

本病例中，患者基因型对应的抗原表达没有出现异常，但抗体水平出现了异常。曾经有国外学者报道过类似案例[8-10]，影响抗体水平表达的机制是该突变位点的单独作用还是联合了别的突变位点，则有待进一步的研究探索。

临床输血实践中，正确的ABO血型鉴定至关重要。血型鉴定错误而导致血液误输注，则可能发生严重的输血反应。因此，一旦发现血清学定型正、反定型不相符，建议进一步完善检测方法。包括血清学中的吸收放散实验、检测血型物质的中和抑制实验等。在有条件的单位，建议进行分子生物学方法的补充，包括PCR-SSP，测序等途径，尽量避免血型鉴定错误的发生，从而保证输血安全。