人工合成启动子的应用

肖红庆 李晓薇 Jameel Aysha 刘伟灿 章婷婷 王一帆 李海燕

（吉林农业大学生命科学学院/生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林 长春130118）

启动子在基因转录的起始和调节中发挥非常重要的作用，在基因工程中是重要的组成构件[1]。天然启动子很难实现连续的、有目的性的调控。对于组成型启动子，一般启动子的序列都比较固定，所以启动子的活性一般也都无法实现更多的调控。而对于诱导型启动子，经过诱导物的诱导之后，通过改变浓度可以在一定的范围内调节启动子的活性，但超出这个范围启动子的活性是不可以调节的。因此，为了获得更多在不同条件下具有不同强度、不同功能的启动子，更为精细的调节基因的表达，近年来，人工合成启动子的研究受到越来越多人的关注。

近年来，生物技术与生物信息学的不断发展，具有特定功能的调控元件在显示出巨大的应用潜力[2]。转录水平的调控直接影响基因的表达水平，而启动子是转录水平的重要调节者，因此，启动子是生物学中的重要调控元件之一[3，4]。人工合成启动子是指按照实践需求合成一段启动子序列，人工合成启动子能够实现对基因进行更为精细和定量的调控，使调控网络中各个基因的表达强度实现最佳组合[5]。人工合成启动子对于植物生物技术、基因治疗和生命科学基本原理研究具有重要价值。本文具体阐述了人工合成启动子工业生产、基因治疗及农业上的应用，并且分析了人工合成启动子的发展趋势。

1 在工业生产上的应用

合成启动子可以通过调节代谢途径生产生物和化学产品，用于工业上大规模的生产过程[6]。在综合的生物系统中启动子存在的遗传不稳定性，是大规模的工业生产中最重要的限制条件[7]。因此，在这些系统中使用合成启动子有助于基因的低水平表达，可以提高遗传稳定性，所以在解决这类问题时设计的合成启动子应该避免重复序列以防止序列重组，另一种解决方法是使用可诱导的启动子。总之，在复杂的基因工程中使用合成启动子技术有利于增加基因的稳定性和提高对调控元件调节效率的控制。例如，在原核生物体内设计表达两种或者更多的酶基因，突变体在几代内会连续增加最终导致基因表达的终止，这是因为突变体在几代内的积累导致基因失活，有研究报道，通过使用不同强度的双启动子对N-乙酰葡糖胺合成路径中Liu 等利用双启动子系统对N-乙酰葡糖胺合成路径中2 个关键酶基因的组合进行优化，使其产量提高了32.4%[8]，说明可以利用合成启动子技术提高某些工业产品的产量。

2 合成启动子用于基因治疗

合成启动子技术的又一重大应用是在疾病治疗上的应用。实际上肿瘤的病毒疗法作为潜在的治疗方法已经有几十年的研究历史，通过产生一类可复制的病毒使其在肿瘤细胞中特异性的复制使肿瘤细胞特异性死亡。有研究报道，应用一个复制的有活性的逆转录病毒能够选择性杀死肿瘤细胞[9]，其原理在于通过在逆转录病毒长末端重复序列上结合前列腺特异启动子，在前列腺特异启动子的基础上设计更多在前列腺癌细胞中有活性的合成启动子，其结果显示，逆转录病毒只在癌细胞中有效的转导和复制，这是一个令人关注的治疗癌症的疗法。

另外，只在循环内皮细胞有活性的启动子对于癌症基因疗法是一个重要的治疗手段。可以使目标新血管在肿瘤中生长以切断供应肿瘤生长的营养，发展一种癌症基因疗法。有研究采用此种方法，cdc6基因的启动子只在分裂的细胞中有活性，使启动子与内皮素增强子元件相结合构建一个在内皮细胞中有活性的合成启动子[10]，在体外4个内皮素元件结合到cdc6启动子上得到了最优的启动子。当将其引入体内时，合成启动子在肿瘤组织中比CMV35S(Cucumber mosaic virus)启动子具有更高的驱动基因表达的效率。

合成启动子在基因治疗方面的另一个重要应用是构建肝脏特异性启动子，在转基因小鼠模型中用来治愈糖尿病[11]。通过随机组合顺式作用元件构建一个在肝细胞中对胰岛素敏感的合成启动子，注射最高剂量病毒的小鼠在50d内未出现高血糖症状。注射由CMV启动子表达胰岛素的腺病毒由于血糖过低导致了小鼠的死亡，这说明基因治疗中对表达的调节是至关重要的，同时说明设计启动子时对基因表达的控制是不可忽视的[12]。

3 植物抗逆上的应用

植物中主要是通过在核心启动子上游组合顺式调控元件来构建胁迫诱导型人工合成启动子。有研究导报利用W1-box、W2-box、GCC-box、JERE等调控元件构建的四聚体构建人工合成启动子，转化合成启动子的转基因植物在受到病原菌胁迫时报告基因GUS的表达结果说明，在受到不同胁迫诱导时，基因的表达水平和启动子的可诱导成都均有所不同[13]。同样通过组合来自小麦的ABRE和来自大麦HVA22的ABRC调控元件，并且与Mini35S启动子融合构建的合成启动子，转化合成启动子的转基因烟草在受到高盐、脱水和脱落酸胁迫时，报告基因GUS的表达水平均有所提高，证明构建的人工合成启动子对某些逆境胁迫有响应[14]。Liu等人通过组合对于植物防御病原菌有作用的顺式调控元件构建人工合成启动子，通过在转基因拟南芥和烟草中的功能分析，在转基因植物手病原菌、水杨酸、乙烯和茉莉酸甲酯等胁迫时，构建的人工合成启动子能够提高报告基因的表达水平[15]。

植物中合成启动子的研究相对较少且大多集中于诱导型合成启动子，主要利用顺式调控元件融合核心启动子的方法构建。Rushton 等[13]曾利用 W1-box、W2-box、GCC 元件、JERE 元件等组合成多种四聚体人工合成启动子。不同病原菌处理下的转基因植株 GUS 分析结果显示，不同启动子的诱导因子、本底表达水平和诱导程度均存在明显差别。通过四拷贝小麦来源的脱落酸应答元件(4×ABRE)或者两拷贝脱落酸应答元件连接两拷贝大麦 HVA22 结合元件(2×ABRC)分别与 Mini 35S 融合发现，合成启动子能够诱导 GUS报告基因在转基因烟草中对高盐、脱水和脱落酸应答表达，证明它们能够作为一种有效的胁迫诱导启动子。Koschmann 等人根据 生物信息学分析结果，筛选到PathoPlant 数据库中的拟南芥芯片数据，挑选出受病原菌诱导上调表达的基因，利用 BEST 软件寻找这些基因启动子区的保守序列，然后与 AthaMap、PLACE 和 AGRIS 数据库中的顺式调控元件比对，挑选与已知顺式调控元件的相似度低的保守序列，通过合成启动子的方法验证[14]。Liu 等人将一些与病原菌和植物防御信号分子诱导相关的顺式调控元件与核心启动子融合并稳定转化烟草和拟南芥，对转基因植株进行病原菌、水杨酸、乙烯和茉莉酸甲酯处理，结果证实合成的诱导型启动子在转基因烟草和拟南芥中能够发挥预期功能[15]。

在农业上，恶劣的环境例如干旱、高盐和低温等条件对作物的产量和产品质量都有较大的影响[16]，遗传转化已经成为一种重要的提高作物抗逆性的手段。合成启动子包含天然启动子区域的调控元件DNA序列，并且它们与天然启动子极大的不同，因为它们可以提供自然界中不存在的表达谱。合成启动子还可以对启动子中某部分序列的功能进行分析验证，合成启动子可以通过有规律的、有目的的组合顺式调控元件来构建，合成启动子中顺式元件的排列可以导致非常精确的转基因表达，而避免了在“全长”启动子序列内存在的另外的元件产生的非特异性表达[17，18]。

转录因子可以调节许多抗逆基因的表达，而且在调节植物对胁迫的响应方面发挥重要的作用，例如ABA响应元件结合因子/ABA响应元件家族[19]。在某些物种中，在其他胁迫响应基因表达的条件下，基本的DREBs/CBFs基因过表达可以对干旱、高盐、低温等胁迫产生抗性[20]。同时AtMYC2和AtMYB2 cDNAs基因的过表达可以提高转基因植物的抗逆性。然而，在正常条件下转基因过表达会阻碍植物的生长和大幅度降低作物产量[21，22]。有研究报道在胁迫诱导处理的拟南芥rd29A启动子的作用下，DREBs/CBFs基因的表达对植物的生长可以产生最小的干扰，可以获得最优的抗逆植株[23]。并且在很多不同的转基因植物中也得到了同样的结论，例如马铃薯[24]、番茄、花生[25]、烟草[21]、大米[26]。通过组合抗逆调节序列构建人工合成启动子，实现了在不同逆境胁迫条件下合成启动子在植物所有的器官和组织中的响应，并且诱导基因有效的表达。

另外，合成启动子在早期检测植物病原体感染方面也有重要的应用价值。在抗病信号传导途径中，许多抗病相关基因的启动子区都包含一系列保守的顺式作用元件，它们对植物抗病响应的精确调控发挥着重要作用。随着对这些顺式作用元件功能的了解，可以通过组合这些有功能的元件，产生用于防治植物病害的诱导型启动子[27]。通过农杆菌浸入法转染烟草，启动子在相应的植物激素处理时具有敏感性和可诱导性，通过拟南芥介导的瞬时表达体系证明合成的诱导型启动子可以对植物病原体的感染进行早期的检测。在作物防病抗病方面，诱导型启动子相对于天然启动子更有优势和利用价值。

4 展望

合成启动子在过去超过20a的时间里，在识别天然启动子重要的结构特点、和调节基因表达方面发挥着重要的作用。近年来，生物信息学的发展和大量实验方法与实验仪器的进步，促进了在严格的调控下能够驱动基因有效表达的高特异性启动子的合成。将来可以设计在病变的细胞、特异组织和感染不同病原体的细胞中有活性的启动子，在临床上用于检测和治疗目前无法得到治愈的疾病。随着生物技术的不断发展进步，成功的实现了在生物系统中的模拟实验。有研究报道目前能够通过[28]利用计算子模型确定了造血干细胞中转录调控模式。随着计算机预测技术在未来的不断发展，实现对启动子表达强度的预测将会成为可能。在对启动子的设计，选择和利用方面将会更加合理。因此在未来构建具有本底活性低、定向表达、启动表达快、表达易调节等特点的人工合成启动子，仍然是将来研究的重点。随着对人工合成启动子研究的不断深入与发展，人工合成启动子在生物制药、农业领域和开发新的基因疗法等方面将会有更加广泛的应用前景。

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