诱导型HSP70与脑损伤关系的研究进展

雷 浪(综述),雷友香,冯 琼(审校)

(1.南昌大学a.研究生院医学部2007级;b.第二附属医院病理科,南昌 330006;2.南昌市精神病院护理部,南昌 330002)

脑损伤具有高致残率和死亡率,主要原因为脑损伤后继发性脑损伤。继发性脑损伤可由脑灌注压不足、脑组织氧代谢障碍、脑内过度炎性反应、受损脑组织对继发性损伤的敏感性增强、脑损伤后致伤因子的释放增加等多种原因引起,可通过不同途径加重脑损伤后的病理生理改变,其实质是脑组织缺血低氧[1]。通过对热休克蛋白家族几十年的研究发现,热休克蛋白家族与脑损伤程度,损伤形成时间以及脑损伤的预后密切相关,其中HSP70族在脑损伤中的作用日益受到人们关注。

1 热休克蛋白家族概况

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)也被称为应激蛋白,是生物体在受热、缺血、缺氧或代谢性毒物等因素刺激时细胞内迅速增加的一组蛋白质,按其分子量大小,可分为 HSP30族、HSP60族、HSP70族、HSP90族等。不同家族的HSPs的亚细胞定位有所区别。其中人类HSP70家族包括至少12名成员。大致可以分为4类[2]:Hsp72,通常在正常细胞中并不表达或表达量很少。但是在热应激或其它应激原的作用下,则表达迅速增加,属于诱导型HSP70;Hsp73,是哺乳动物细胞内的结构蛋白,在所有的细胞内均能表达,并且受热诱导,属于结构型HSP70;Grp78(葡萄糖调节蛋白78,glucose-regulated protein 78),这种蛋白位于内质网腔内;Hsp75,也称为mtHsp70,主要位于线粒体内,Grp78和Hsp75在应激时稍有表达,它们在细胞内以分子伴侣的形式发挥作用。值得注意的是:正常情况下诱导型HSP70位于细胞浆内,当细胞受到应激刺激时,细胞核内诱导型HSP70迅速增加,细胞浆内只有少量存在,细胞处于恢复阶段时,细胞核内的诱导型HSP70消失,细胞浆内仍有低水平诱导型HSP70表达[3]。

2 诱导型HSP70与脑损伤细胞凋亡

诱导型HSP70已经被证明具有神经保护作用,最初认为这是作为分子伴侣的保护机制。但是最新研究显示,诱导型HSP70能直接干扰细胞凋亡和坏死信号通路,并且可能参与调节炎症反应[4]。

2.1 诱导型HSP70抑制线粒体凋亡通路的激活

线粒体凋亡通路的启动始于线粒体释放促凋亡因子进入胞浆。正常情况下这些促凋亡因子包括细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor)、Smac/DIABLO(second mitochondrial delived activator of caspases/direct IAP-binding protein with a low isoelectric point)、核酸内切酶G(endonuclease G)等,其中Cyt C是一重要因子。Cyt C从线粒体释放到胞浆后,和CED-4同源物,凋亡酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1),三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)相互作用形成“凋亡体”(apoptosome)并且激活caspase-9,从而启动caspase级联反应。caspase-9激活caspase-3,caspase-3激活脱氧核糖核酸酶(DNase),导致细胞凋亡[5]。刘华等[6]采用重物自由落体造成大鼠急性脑干损伤模型,通过酶联免疫的方法检测急性脑干损伤组织神经元胞浆Cyt C的含量较非脑干损伤组为高。诱导型HSP70能通过抑制Cyt C的释放,并且抑制凋亡诱导因子易位到核上,最终减轻缺血性脑损伤。转基因老鼠过度表达诱导型HSP70后,诱导型 HSP70具有明显保护脑缺血损伤的作用,作用机制是诱导型HSP70干扰apoptosome的生成以及隔绝凋亡诱导因子[7]。Jiang B.等[8]通过免疫印迹和间接免疫荧光分析的方法观察到Smac/DIABLO能够从肌细胞线粒体中释放,而诱导型 HSP70能够抑制Smac/DIABLO的释放并达到减少肌细胞凋亡的作用。

2.2 诱导型HSP70对Bcl-2家族的调节

Bcl-2家族蛋白成员在细胞凋亡中起重要作用,它们共同构成一个非常复杂的相互作用网络,调控细胞凋亡。Bcl-2家族成员之间可形成同源二聚体或异源二聚体,调节细胞死亡和存活信号的平衡状态,是决定细胞存亡的关键。细胞凋亡的线粒体途径通过Bcl-2家族蛋白调节。主要的的抗凋亡成员Bcl-2和Bcl-xL在线粒体外膜发挥作用,以维持膜的完整性。相反,主要的促凋亡成员Bax和Bak通过破坏线粒体膜的完整性发挥作用。Bcl-2能阻断Cyt C和凋亡诱导因子的释放,减少caspase的激活,最终起到抗凋亡作用[9]。在脑细胞中,通过病毒介导使得诱导型HSP70过度表达之后,Bcl-2蛋白的水平明显增高。转基因后Bcl-2过度表达,局灶性脑缺血的梗死灶明显缩小了;相反,Bcl-2基因敲除后的老鼠,梗死灶的范围将增加[10]。也就是说,增加诱导型HSP70的表达或者直接通过增加Bcl-2水平可以减少细胞凋亡。诱导型HSP70通过抑制Bax的易位,阻碍线粒体中促凋亡因子的释放,达到抗细胞凋亡作用。

2.3 诱导型HSP70对转录因子的调节

转录因子在调节细胞死亡中起关键作用。诱导型HSP70能够干扰细胞信号传导通路导致转录因子的活化。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联是细胞内重要的信号转导系统之一。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是 MAPK家族中的重要成员。Kitamura C.等[11]在研究大鼠牙髓细胞凋亡中发现,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路是导致创伤后神经细胞凋亡的重要途径之一,而诱导型HSP70是其中的一种抑制分子:诱导型HSP70能够抑制JNK的脱磷酸化,阻碍其激活从而起到抗牙髓细胞凋亡的作用。研究表明,诱导型HSP70能够抑制JNK的脱磷酸化,阻碍其激活。活化的JNK能够使转录因子c-Jun磷酸化,从而使一系列特殊的蛋白表达上调。JNK在神经系统中不仅仅是促进细胞凋亡。在正常生理功能下,神经系统中JNK的基础水平比其他组织中更高。诱导型HSP70还能和拓扑异构酶1相互作用从而调节细胞凋亡。这种机制被证明是不受ATP结合结构域的影响。诱导型HSP70作为抗凋亡促存活激酶AKt/PKB的重要效应物 ,与 κ B(cnuclear factor-kappaB,NFκ B)作用,从而较少它的活化[12]。

3 诱导型HSP70与炎症

脑缺血后,白细胞浸润所致的炎症反应,在缺血性脑损伤的发生发展中起重要作用。炎症能加重中风造成的损伤。炎症反应包括固有小胶质细胞和星形胶质细胞的激活以及促进周边炎性细胞聚集。在脑缺血造成的炎症反应中,诱导型HSP70也发挥了重要的调节作用。细胞内诱导型HSP70参与了一系列的抗炎反应。它能阻断炎症因子的反应,例如肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素1(IL-1)。高剂量TNF刺激的老鼠受到了诱导型HSP70的保护后,避免了感染性休克致死。然而丢失hsp70-1基因的老鼠确没有得到这种保护机制[13]。炎症通过激活诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)和NADPH氧化酶来产生活性氧化物,而诱导型HSP70能通过几条路径限制活性氧化物的产生。有研究显示:在神经胶质细胞中,iNOS的激活是受细菌内毒素和/或前炎症细胞因子刺激诱导的,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能够诱导 NFκ B转录到核上,而诱导型HSP70能够通过干扰NFκ B的激活最终达到抑制iNOS的激活以减少过氧化物的产生[14]。诱导型HSP70能降低中性粒细胞中NADPH氧化酶的活性,并且增加过氧化物歧化酶,以减少巨噬细胞中的过氧化物产生[15]。在星形胶质细胞中,低氧低血糖刺激下,诱导型HSP70的过度表达能够减少活性氧化物的产生,稳定线粒体膜电位,维持其正常生理功能,保护大脑对局灶性脑缺血的损伤[16]。在心肌细胞中,诱导型HSP70的过度表达能够增加线粒体锰过氧化物歧化酶的活性,从而达到保护线粒体和减少心肌细胞凋亡的作用[17]。诱导型HSP70是通过调节NFκ B途径来完成它的炎症调节功能。NFκ B是免疫一炎症反应的核心转录因子。NFκ B通常与抑制蛋白家族Iκ B相结合,以无活性的三聚体形式存在于胞浆中。感染、缺血/氧、组织损伤等刺激作用下,Iκ B 被 IKK(Iκ B kinase)磷酸化,继而发生泛素化,最后被265蛋白酶体降解,游离出的NFκ B转位至细胞核内,与靶基因调控元件中的κ B序列特异性结合,单独作用或与其它转录因子协同作用,调节靶基因表达。包括TNF、IL-1、iNOS和基质金属蛋白酶-9[18]。诱导型HSP70能够抑制NFκ B转导到核内。在脑中风大鼠模型中,诱导型 HSP70的过度表达能够减少NFκ B的激活。诱导型HSP70的这种功能是通过与NFκ B蛋白直接作用或者和NFκ B调节通路中其他蛋白作用来完成的[19]。

4 诱导型HSP70在脑损伤研究中的临床以及法医学应用前景

Mikawa S.等[20]用落体撞击法复制小鼠闭合性颅脑损伤模型,并且分1、4、24和48 h等4组,用原位杂交技术观察了诱导型HSP70 mRNA的表达情况,发现损伤后1 h组没有明显改变,损伤后4 h和24 h组HSP70 mRNA在脑损伤灶周围有明显表达,损伤后48 h组恢复正常水平。大鼠脑部液体冲压伤(2.2～2.4 atm)后2 h,通过原位杂交技术观察到诱导型HSP70 mRNA的表达局限于挫伤区域的周围皮质;伤后6 h,诱导型HSP70 mRNA在深部皮质层和最大损伤区域的上部皮质层中持续表达;伤后24 h,大脑所有区域的HSP70 mRNA均降至与对照组相当的水平[21]。Allen G.V.等[22]对小脑局灶性砸伤的大鼠的研究发现,在重度砸伤后,诱导型HSP70主要集中表达于创伤区域的颗粒细胞和同侧深部小脑核;轻度砸伤,诱导型HSP70则仅表达于颗粒细胞层。由此可以看出,诱导型HSP70表达与脑损伤程度有关。有研究显示:在小鼠闭合性颅脑损伤模型上,诱导型HSP70 mRNA水平仅在大脑皮层短暂性增高,峰值则出现在伤后1 h(6倍于对照组)[23]。裘天仑等[24]通过免疫组化的方法检测了诱导型HSP70在人脑挫伤组织的表达,结果发现挫伤脑组织诱导型HSP70阳性细胞的比例在6～24 h最多,随着时间的推移,逐渐减少,但诱导型HSP70表达时间较长,最长至7 d时仍有少量表达。诱导型HSP70与脑损伤程度明显相关,创伤越重,挫伤脑细胞的诱导型HSP70表达越高。但当脑组织受到不可逆损伤时(GCS评分3～5),诱导型HSP70的表达急剧下降。朱金龙等[25]用落体撞击法复制大鼠弥漫性脑损伤模型,伤后分0.5、1、3、6、12 h,1、3、7 d及 10 d共 9组分别与小脑脑干部冠状切面和距大脑交界处2 mm作冠状切面取材(1 cm×1 cm),然后制作免疫组化染色,结果显示伤后3 h及6 h诱导型HSP70表达明显增多,伤后12 h达到高峰,伤后1 d阳性细胞数量开始减少,伤后3 d开始恢复,伤后7 d基本恢复正常。

在对败血症患者的报道中,其外周血淋巴细胞的诱导型 HSP70的表达明显下降。血清诱导型HSP70高浓度水平能够改善创伤和严重的败血症患者的预后[26]。有研究表明,心肌梗死和心脏搭桥手术后,发现诱导型HSP70表达大量增加[27]。因此,高水平的HSPs表达可以提示组织损伤,同时也表明应激反应越多,相关组织就会得到更加良好的保护和更好的预后。诱导型HSP70对于危重病患者和围手术期患者的器官功能障碍起到了防止作用。基因疗法和化学诱导应激疗法目前正被视为一种全新疗法应用于多器官缺血的治疗,包括使用谷氨酰胺来增加诱导型HSP70而达到治疗病危患者[28]。

诱导型HSP70在各种类型脑损伤中的表达不仅是细胞受损的标志,而且是脑损伤病情恶化的预测指标[29]。诱导型 HSP70是重要的神经保护因子,有着防止迟发性神经元死亡、对抗氧化应激、抗凋亡等作用,它在防止细胞损害和促使受损细胞恢复方面的作用已得到公认。但是国内外尚未对诱导型HSP70的表达和脑损伤程度的相关性上做更为深入的研究,随着基因技术、生物工程的发展,诱导型HSP70在脑损伤程度的法医鉴定中将会有广阔的前景。

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