光动力疗法单用或联合抗真菌药物对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影响

徐玉亭 郑文倩 高露娟 孙毅 李琳芸 李明 曾同祥

434100湖北荆州，长江大学第二临床医学院（徐玉亭、郑文倩）；复旦大学附属中山医院皮肤科（高露娟、李明）；长江大学第二临床医学院附属荆州市中心医院皮肤科（孙毅、曾同祥），检验科（李琳芸）

皮炎外瓶霉感染治疗棘手，临床中采用两性霉素B、伏立康唑及伊曲康唑治疗的成功率只有44%、50%和71.4%［1-2］。真菌生物膜的形成是感染播散、耐药及治疗效果差的重要原因之一［3］。多项研究证实，皮炎外瓶霉能够形成生物膜，且对常规抗真菌药物耐药［4-5］。近年来，抗微生物光动力疗法已被证明对多种致病性真菌有体外杀伤作用，同时在临床中也已成功用于着色芽生菌病、甲真菌病等的辅助治疗［6］。我们前期研究证实，光动力疗法能高效杀伤游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉，且与抗真菌药物具有协同杀伤效应［5］。在此研究基础上，我们进一步探索光动力疗法单独或联合抗真菌药物对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡发生的影响。

材料与方法

一、实验菌株

皮炎外瓶霉临床分离株ATCC34100（北京大学第一医院皮肤科李若瑜教授惠赠），实验前用沙氏培养基活化1周，以保证受试真菌的活力及纯度。

二、实验用药

伊曲康唑（批号84625-61-6，纯度＞99%）、伏立康唑（批号137234-62-9，纯度＞99%）、两性霉素B（批号1397-89-3，纯度 ＞80%）均为美国Sigma-Aldrich公司产品，泊沙康唑（批号S1257，纯度 ＞99%）为美国Selleck chemicals公司产品，各药物储存液浓度均为1 600 mg/L。光动力疗法光敏剂为亚甲蓝（美国Sigma-Aldrich公司，批号1001968916），工作液浓度为8 mg/L。

三、制备游离态孢子悬液

将活化后的皮炎外瓶霉接种于沙氏培养基7 d，用含0.03%Triton的无菌蒸馏水收集孢子，以血细胞计数板将孢子浓度调至1×106/ml～5×106/ml，然后用RPMI 1640液体培养基稀释100倍，27℃，于摇床180 r/min（离心半径为20 mm）振荡孵育48 h，收集孢子，用生理氯化钠溶液制作孢子悬液，浓度为1×106/ml～5×106/ml。

四、构建皮炎外瓶霉生物膜

通过改良的96孔板法［3］构建。制备1×107/ml孢子悬液，在96孔板每孔中加入200 μl上述菌悬液，于37℃培养72 h。去掉上层培养基，避免破坏底部的生物膜，并用无菌磷酸盐缓冲液清洗3次以去除悬浮的孢子。

五、药物及光动力处理

皮炎外瓶霉游离态孢子与生物膜分别均分为单药组、光动力组、光动力联合药物组以及空白对照组。药物包括两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑。单药组用制备好的游离态菌悬液和生物膜分别接受4种抗真菌药物处理，药物工作浓度均为1 mg/L，处理时间均为2 h。光动力组：向皮炎外瓶霉游离态孢子和生物膜中加入亚甲蓝，工作浓度8 mg/L，用光动力治疗仪（机型C86C15100338，深圳普门科技有限公司）照射［波长（635±10）nm］2 min，然后37℃避光孵育2 h。光动力联合药物组：皮炎外瓶霉游离态孢子和生物膜经过上述光动力处理后，分别加入伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B和泊沙康唑并孵育2 h，药物终浓度均为1 mg/L。空白对照组不加药物，不进行光动力处理，仅在37℃孵育2 h。

六、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡

采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 488，上海翊圣生物科技有限公司）检测，按说明书进行。用EpicsXL流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）在（520±20）nm波长荧光下观察绿色荧光，在＞620 nm波长的荧光下观察碘化丙锭（PI）染色后的红色荧光。所有实验均重复3次。

七、统计学方法

采用SPSS22.0软件进行析因方差分析，组间多重比较采用LSD检验。用GraphPad PRISM软件进行图表统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、光动力疗法及抗真菌药物对游离态皮炎外瓶霉凋亡的影响

析因方差分析显示，不同的抗真菌药对游离态皮炎外瓶霉凋亡率有显著影响（F=16.326，P＜0.001），光动力疗法对其凋亡亦有影响（F=112.321，P＜0.001），光动力疗法与抗真菌药对游离态皮炎外瓶霉凋亡无交互作用（F=1.776，P=0.173）。

空白对照组和两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑单药组凋亡率分别为11.67%±0.21%、13.30%±1.78%、14.30%±3.61%、14.51%±1.91%、36.17%±4.00%，其中伊曲康唑单药组凋亡率显著高于空白对照组（P＜0.05），两性霉素B、泊沙康唑及伏立康唑单药组与空白对照组间差异均无统计学意义（P=0.458、0.242、0.210）。

光动力组凋亡率为41.37%±7.80%，显著高于空白对照组（P＜0.05）。光动力联合两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑组凋亡率分别为29.23%±6.71%、37.23%±10.86%、43.57%±6.42%、69.87%±3.53%，其中，光动力联合伏立康唑组及伊曲康唑组凋亡率均分别显著高于伏立康唑及伊曲康唑单药组（均P＜0.05）。光动力联合伊曲康唑组凋亡率显著高于光动力组（P＜0.05），而光动力联合两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑组凋亡率与光动力组相比差异无统计学意义（均P＞0.05）。

二、光动力疗法及抗真菌药物对形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影响

析因方差分析显示，不同的抗真菌药对形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡率有显著影响（F=5.591，P=0.030），光动力疗法对其凋亡亦有影响（F=20.466，P＜0.001），光动力疗法与抗真菌药对形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡无交互作用（F=2.25，P=0.065）。

空白对照组、两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑单药组凋亡率分别为25.30%±1.31%、29.90%±3.91%、33.67%±9.03%、38.87%±4.89%、46.13%±6.81%，伏立康唑、伊曲康唑组显著高于空白对照组（P=0.042、0.005）。

光动力组凋亡率为32.00%±0.43%，显著高于空白对照组（P＜0.05）。光动力联合两性霉素B（62.63%±10.79%）、泊沙康唑（43.20%±2.87%）、伏立康唑（49.83%±3.38%）、伊曲康唑组凋亡率（56.73%±5.24%）均较相应单药组有所升高，其中光动力联合两性霉素B组凋亡率显著高于两性霉素B单药组（P＜0.05）。光动力联合两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑组凋亡率均显著高于光动力组（均P＜0.05）。

讨 论

在病原真菌感染方面，光动力疗法被认为是一种极具潜力的无创性替代治疗方案。体外研究证明，光动力对念珠菌、皮肤癣菌、申克孢子丝菌、镰刀菌、裴氏着色霉及卡氏枝孢瓶霉等致病真菌有杀伤作用［7-10］。在临床上，光动力疗法已成功用于治疗甲真菌病、着色真菌病等，并取得良好的疗效［11-13］。此外，光动力还能抑制对常规药物耐药的真菌生物膜［14］。

我们的前期研究显示，皮炎外瓶霉生物膜对常用抗真菌药物不敏感，唑类药物（伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑）和两性霉素B对皮炎外瓶霉生物膜的50%最小抑菌浓度（SMIC50）分别≥16 mg/L和1～2 mg/L，80%最小抑菌浓度分别≥16 mg/L和4～8 mg/L［5］。然而，以亚甲蓝为光敏剂的光动力疗法不仅能高效杀伤皮炎外瓶霉游离态孢子和生物膜，还能显著增加其对抗真菌药物的敏感性［5］。

基于以往的研究结果，我们进一步探索光动力单用或联合抗真菌药物对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡发生的影响。结果显示，抗真菌药物虽然能一定程度上增加皮炎外瓶霉游离态孢子和生物膜的凋亡率，但与对照组相比，差异并无统计学意义；相反，光动力疗法能够显著增加游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉的凋亡率。而且，光动力联合药物组与单药组相比，凋亡率也明显增加，提示诱导凋亡发生可能是光动力对皮炎外瓶霉杀伤的重要机制之一。因此，联合光动力疗法能增强抗真菌药物对皮炎外瓶霉的促凋亡作用，本研究打破了抗真菌药物单独治疗皮炎外瓶霉的局限性，为皮炎外瓶霉感染的治疗提供了新的思路。

本研究还提示，光动力联合药物组游离态皮炎外瓶霉凋亡率比单药组均有所升高，但除伊曲康唑外其他抗真菌药与光动力联合组与光动力组却无明显差异，提示两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑这几种抗真菌药物对皮炎外瓶霉凋亡发生无明显作用。而就皮炎外瓶霉生物膜来说，光动力联合各药物组凋亡率不仅比相应单药组明显升高，较光动力组也均明显升高。可见，光动力联合抗真菌药物对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡的影响存在一定的差异，而造成这种差异的潜在机制尚有待进一步研究。

本研究采用TUNEL试剂盒联合流式细胞仪来检测细胞凋亡，该方法有一定局限性，只能识别凋亡细胞，无法识别坏死细胞。我们推测，光动力和药物均能诱导皮炎外瓶霉凋亡或坏死，其中抗真菌药物更容易造成皮炎外瓶霉的坏死，而光动力更容易诱导其凋亡的发生。抗真菌药物联合光动力时，可能造成坏死率上升，而凋亡率下降。其具体的机制还有待进一步研究。

本研究初步探索抗真菌药物及光动力对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡发生的影响，并证实光动力能够显著促进游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉凋亡，这可能是光动力对游离态及形成生物膜的皮炎外瓶霉的重要杀伤机制之一。然而，光动力与药物联合的机制较为复杂，尚需进一步研究。