紫外分光光度法测定原料药喜树碱含量分析

李家敏 周秀玲 王金华 张兵锋

摘要：由于喜树碱内酯环开环后在254 nm波长下紫外吸收增强，而开环的喜树碱毒副作用大。鉴于目前喜树碱含量测定均采用254 nm，且喜树碱在大多数溶剂中溶解性较差，为更准确便捷地检测喜树碱原料药的含量，有必要探索在新的波长下测定喜树碱含量的方法。将喜树碱在200～400 nm扫描，发现在367 nm处有较大吸收，且溶剂二甲基亚砜无干扰。因此采用367 nm波长下测定喜树碱含量，并进行含量测定方法学考察。喜树碱的标准曲线方程为y=0.042 3x+0.013 2，r=0.999 6，浓度在4～20 μg/mL与其吸光度呈现良好的线性关系。平均加样回收率为101.76%，RSD为0.75%，结果重现性良好，符合方法学要求。在367 nm波长下测定喜树碱含量，所受干扰较小，测定结果可信度高。

关键词：喜树碱;紫外分光光度法;二甲基亚砜

中图分类号：O657.32         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）21-0109-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.027           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Camptothecin Content by Ultraviolet Spectrophotometry

LI Jia-min，ZHOU Xiu-ling，WANG Jin-hua，ZHANG Bing-feng

（College of Chemistry and Bioengineering，Yichun University，Yichun 336000，Jiangxi，China）

Abstract： The ultraviolet absorption of camptothecin was increased at 254 nm after the lactonic ring opening，and the toxicity of camptothecin was aslo increased. In view of the current determination of camptothecin content at 254 nm，a new method content was explored for determination of camptothecin.Camptothecin had a large absorption at 367 nm from 200 nm to 400 nm，and dimethyl sulfoxide was undisturbed. Therefore，the content of camptothecin was determined at 367 nm and the methodology was investigated. The regression equation is y=0.042 3x+0.013 2，r=0.999 6. The concentration of camptothecin was in a good linear relationship with its absorbance within the range of 4～20 μg/mL. The average recovery of sample was 101.76% and RSD was 0.75%， the results had good reproducibility and more reliable.

Key words： camptothecin; ultraviolet spectrophotometry; content

喜树碱（Camptothecin，CPT）是一种抗癌植物药，是含有喹啉环的生物碱。其最早是在1966年，由美国化学家从喜树中分离提取而得到纯度较高的喜树碱单体[1]。喜树碱具有广谱的抗癌功效、一定的免疫抑制作用以及抗病毒疗效[2]。喜树碱主要是作用于I型拓扑异构酶，通过抑制DNA代谢过程，发挥抗肿瘤活性[3，4]。喜树碱的水溶性较差，在临床上应用有一定的限制。当前采用紫外分光光度法测定喜树碱原料药的含量时，一般采用254 nm波长。研究发现，喜树碱在254 nm波长处的吸收峰受光和热的影响较大，有时甚至会导致其最大吸收峰消失[5]。此外，开环的喜树碱在此波长下紫外吸收显著增强，但喜树碱开环后疗效降低，毒性增加。因此，用该波长测定喜树碱原料药的含量，测定结果不能完全真实反应出具有生物活性的喜树碱含量。喜树碱易溶于二甲基亚砜，难溶于其他有机溶剂。为更准确地检测喜树碱的含量，以二甲基亚砜作为溶剂，并探索喜树碱新的检测波长及含量测定方法，来用于方便快捷地检测喜树碱原料药的含量。

1  材料与方法

1.1  药品与试剂

喜树碱标准品（天津希恩思生化科技有限公司）;二甲基亚砜（DMSO，天津市永大化学试剂有限公司）;喜树碱原料药（天津希恩思生化科技有限公司）;去离子水。

1.2  仪器

SQP天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;TU-1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3  方法

1.3.1  喜树碱标准品的配制  精密称量喜树碱标准品10.0 mg，加入二甲基亚砜溶解，然后转移至100 mL量瓶中定容，搖匀，即得到浓度为100 μg/mL喜树碱标准品溶液。注意避光，室温存留备用。

1.3.2  喜树碱原料药供试品溶液的配备  精密称量喜树碱原料药约10 mg，加入二甲基亚砜溶解，于100 mL的量瓶中定容，摇匀，即得喜树碱原料药供试品溶液。注意避光，室温保存备用。

1.3.3  标准曲线的绘制  精密移取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL喜树碱标准品溶液置于10 mL量瓶中，然后分别向各个量瓶中加入二甲基亚砜定容。以二甲基亚砜作为调零溶液，在367 nm波长处分别测定以上喜树碱标准品溶液的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2  结果与分析

2.1  最大吸收波长的确定

在200～400 nm波长范围内对溶剂二甲基亚砜和喜树碱标准品溶液进行扫描，全波长扫描结果见图1。由图1可见，喜树碱标准品溶液在254 nm处有最大吸收峰，同时发现其在367 nm处也有一较大吸收峰;二甲基亚砜在254 nm波长处有明显吸收，但它在367 nm波长处基本无吸收。因此，试验最终选定367 nm作为测定波长。

2.2  标准曲线的绘制

以二甲基亚砜作为调零溶液，在367 nm波长处分别测定“1.3.3”喜树碱标准品溶液的吸光度。最终测定的吸光度依次是0.177、0.357、0.523、0.695、0.855。以喜树碱标准品溶液的浓度x（μg/mL）为横坐标，吸光度y为纵坐标，制作标准曲线，拟合线性回归方程。由此得线性回归方程为：y=0.042 3x+0.013 2，r=0.999 6。结果表明，喜树碱标准品溶液浓度在4～20 μg/mL范围内呈现良好的线性关系（图2）。

2.3  精密度试验

准确量取喜树碱标准品溶液0.8 mL，共6份，分别置于10 mL的量瓶中，加二甲基亚砜定容，以二甲基亚砜溶液为调零溶液，在367 nm处测吸光度，其结果见表1。平均吸光度为0.357，相对标准偏差RSD为0.33%，符合精密度试验要求，说明仪器精密度较好，测定结果准确。

2.4  重复性

量取喜树碱供试品溶液0.8 mL共6份，分别置于已编好号的10 mL量瓶中，用二甲基亚砜定容，同时以二甲基亚砜作为调零溶液，在367 nm处测吸光度，试验结果见表2。由表2可知，平均吸光度为0.377，相对标准差RSD为0.37%，表明此方法具有良好的重现性。

2.5  稳定性

准确吸取喜树碱供试品溶液0.8 mL，接着转移至10 mL的量瓶中，并向其中加二甲基亚砜定容，以二甲基亚砜溶液为空白，在367 nm处每隔20 min测定1次吸光度，共测6次，结果见表3。由表3可知，平均吸光度为0.357，相对标准偏差RSD为0.56%，说明此测定方法稳定性较好。

2.6  加样回收率

取测得含量的喜树碱供试品溶液6份，各0.6 mL置于10 mL的量瓶中，编好序号。1、2、3号中分别加入精密量取的喜树碱标准品溶液0.6 mL，4、5、6号中分别加入精密量取的喜树碱标准品0.8 mL。接着向各个量瓶中分别加入二甲基亚砜定容，并且以二甲基亚砜溶液作为空白，在367 nm处测定吸光度。计算加样回收率、平均加样回收率和RSD，精密度试验结果见表4。由表4可知，平均加样回收率为101.76%，相对标准偏差RSD为0.75%，符合加样回收率要求，说明此方法测定结果的准确度较好。

2.7  喜树碱含量测定

准确量取0.8 mL的喜树碱供试品溶液，置于10 mL的量瓶中，加入二甲基亚砜定容。在367 nm波长处测定其吸光度，平行3次，根据标准曲线即可求得喜树碱原料药的含量，结果见表5。由表5可知，喜树碱原料药的平均含量为99.10%，相对标准偏差RSD为0.16%。

3  小结与讨论

紫外分光光度法是原料药以及制剂含量测定常用的分析方法之一。目前对喜树碱的含量测定简便快捷的方法是采用紫外分光光度法，采用的测定波长为254 nm。对喜树碱标准品溶液进行全波长扫描，结果表明，喜树碱标准品在254 nm处有最大吸收峰，同時它在367 nm处也有一较大的吸收峰。结合唐明珠[5]的研究，喜树碱在254 nm处虽然有最大吸收，但其受光和热的影响较大，结果重现性低;而在367 nm下的吸收峰却受光和热的影响较小。二甲基亚砜在254 nm处有一明显吸收峰，这与喜树碱标准溶液的最大吸收峰有重叠，但在367 nm处基本无吸收，选取367 nm作为检测波长可避免上述问题。

采取紫外分光光度法在367 nm波长处测定喜树碱原料药含量时，标准曲线为y=0.042 3x+0.013 2，r=0.999 6，说明喜树碱标准品浓度与其在367 nm处的吸光度之间具有良好的线性关系。同时利用标准曲线和紫外分光光度计得出喜树碱原料药的平均含量为99.10%，并且精密度、稳定性、重复性以及加样回收率均良好，符合含量测定要求。所以，在367 nm波长下，以二甲基亚砜为溶剂，选用紫外分光光度法测定喜树碱原料药的含量具有一定的可行性，可为喜树碱原料药的含量测定等提供一种更加准确、简便、适用的方法。

参考文献：

[1] WALL M E，WANI M C，COOK C E，et al. Plant antitumor agents. I. The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from camptotheca acuminata1，2[J].Journal of the American Chemical Society，1966，88（16）：3888-3890.

[2] 郭  辰，李  真.喜树碱的全合成研究进展[J].科技资讯，2009（1）：247-248.

[3] HSIANG Y H，HERTZBERG R，HECHT S，et al. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I[J].Journal of Biological Chemistry，1985，260（27）： 14873-14878.

[4] 陈梦涵，杨鸣华，孔令义.喜树碱类药物的研究与开发[J].世界科学技术-中医药现代化，2016，18（5）：724-730.

[5] 唐明珠.光和热对喜树碱含量测定的影响[J].中国药学杂志，1983（1）：8-9.