复方斑蝥胶囊对原发性肝癌患者介入治疗后细胞免疫功能的影响*

赵延军，单宇鹏

空军军医大学唐都医院肿瘤科 (西安 710038)

介入治疗可通过碘油栓塞供应原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的动脉并进行局部灌注化疗，但由于HCC患者存在免疫细胞功能衰竭或失能导致机体无法彻底清除肿瘤细胞[1]，造成治疗后肿瘤复发及转移，必须进行辅助药物治疗，重建机体免疫应答。复方斑蝥胶囊具有破血消瘀、攻毒蚀疮的功效，有研究发现复方斑蝥胶囊具有升高白细胞的功能[2]。本研究观察了复方斑蝥胶囊对HCC患者介入治疗后细胞免疫功能的影响。

资料与方法

1 一般资料 参照2005年修订的巴塞罗那(BCLC)原发性肝癌分期标准，选择2016年9月至2017年6月在第四军医大学唐都医院住院的原发性肝癌B期和C期患者42例，其中男性29例，女性13例，平均年龄(51.9±11.8)岁，所有患者在行介入治疗前均未接受任何干预治疗。采用随机数字表法将其随机分为2组，分别为介入治疗组(21例)和介入治疗后联合复方斑蝥胶囊(国药准字Z19993294，组方：斑蝥、人参、黄芪、刺五加、三棱、半枝莲、莪术、山茱萸、女贞子、熊胆粉、甘草)治疗组(21例)，复方斑蝥胶囊用量为1g/次，3次/d，连续服用4周。两组间性别、年龄、临床分期无显著差异。同时选取第四军医大学唐都医院健康体检者20例(男性11例，女性9例，平均年龄49.1±6.9岁)作为健康对照组。

2 介入治疗方法 经皮股动脉穿刺，在超滑导丝引导下降5F的RH导管头端置于腹腔动脉，高压注入适量碘佛醇行正位DSA，根据DSA显影结果确定肿瘤供血动脉。将RH导管先端置于肝内供瘤沉积部位，缓慢灌注5-氟尿嘧啶、洛铂或奥沙利铂，再将碘油与吡柔比星充分混合后行栓塞术，根据患者个体情况和肿瘤大小确定用药剂量。术毕退出导管，穿刺点加压包扎止血。

3 试剂和仪器 淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司，抗人CD3-FITC、抗人CD4-PerCP Cy5.5、抗人CD8-APC、抗人CD56-PE、抗人CD19-APC购自美国BD公司， FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。

4 外周血单个核细胞(PBMC)分离和流式细胞检测 分别于介入治疗前和治疗后4周收集入组志愿者的抗凝外周血10ml，利用密度梯度离心法分离PBMC，分别取106个PBMC转入FACS管中，其中一管加入抗人CD3-FITC、抗人CD4-PerCP Cy5.5、抗人CD8-APC和抗人CD56-PE，另一管加入抗人CD19-APC，避光4°C孵育20min，应用PBS洗涤2次后加入2%多聚甲醛/PBS，上机检测。使用CellQuest Pro软件获取细胞，使用FlowJo7.6.2软件分析结果。

5 统计学方法 使用SPSS 19.0软件对数据进行分析。使用Studentt检验对组间结果进行比较，使用配对t检验对治疗前后结果进行比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

1 两组患者接受介入治疗前后肝功的变化 如表1所示，两组患者在行介入治疗前血清ALT、AST和T-BIL比较无明显差异，治疗后4周两组患者之间比较肝功检查亦无明显差异。两组患者ALT、AST和T-BIL水平在治疗前后比较亦无明显差异(P<0.05)。

表1 两组原发性肝癌患者介入治疗前后ALT、AST和T-BIL的变化

2 健康志愿者与原发性肝癌患者外周血免疫细胞比例的比较 应用流式细胞术检测CD3+T细胞(图1A)、CD4+T细胞(CD3+CD4+，图1B)、CD8+T细胞(CD3+CD8+，图1C)、NK细胞(CD3-CD56+，图1D)、NKT细胞(CD3+CD56+，图1D)、B细胞(CD19+，图1E)的比例。如表2所示，原发性肝癌患者在行介入治疗前CD3+T细胞、CD4+T细胞和NKT细胞的比例与健康志愿者比较无明显差异，但原发性肝癌患者外周血CD8+T细胞、NK细胞和B细胞的比例较健康志愿者显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 健康志愿者与原发性肝癌患者外周血免疫细胞的比较(%)

注：与健康志愿者比较，*P<0.05

3 两组原发性肝癌患者介入治疗前后免疫细胞比例的变化 见表3。介入治疗前外周血免疫细胞的比例在两组患者之间无明显差异。单纯进行介入治疗的患者中，治疗4周后外周血免疫细胞的比例与治疗前比较亦无明显变化(P>0.05)。而在接受介入联合复方斑蝥胶囊治疗4周后，患者外周血CD8+T细胞和NK细胞的比例较治疗前显著升高(P<0.05)，但其它免疫细胞比例在治疗前后无明显变化(P>0.05)。

表3 两组原发性肝癌患者介入治疗前后外周血免疫细胞的比较(%)

注：与治疗前比较，*P<0.05

A：CD3+T细胞，B：CD4+T细胞，C：CD8+T细胞，D：NK细胞和NKT细胞，E：B细胞图1 典型流式细胞检测分析

讨 论

恶性肿瘤患者存在免疫功能失调，主要表现为免疫细胞表面多种抑制性受体(如：PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3等)表达升高，造成免疫细胞失能甚至功能衰竭，不能清除肿瘤细胞，导致肿瘤迅速进展和/或转移的发生[3]。既往的许多研究均发现，原发性肝癌患者中存在多种免疫细胞的功能不全，特别是CD8+T细胞的功能衰竭[4-5]。在我国，原发性肝癌多由慢性肝炎病毒感染所致的肝硬化演变而来，慢性病毒感染和肿瘤双重因素均加剧了免疫细胞功能衰竭，造成疾病的进展。本研究对原发性肝癌患者外周血中不同免疫细胞的比例进行了分析，并与健康志愿者进行了比较，发现原发性肝癌患者外周血中CD8+T细胞、NK细胞和B细胞的比例较健康志愿者显著降低，但CD3+T细胞、CD4+T细胞和NKT细胞的比例与健康志愿者比较无明显变化。CD8+T细胞和NK细胞均具有较强的免疫杀伤功能，CD8+T细胞是细胞毒性细胞，可通过分泌穿孔素、粒酶以及多种细胞因子特异性杀伤靶细胞[6]；NK细胞是固有免疫系统的重要组成部分，具有细胞毒功能和分泌细胞因子/趋化因子的能力，在无致敏情况下具有自发杀伤肿瘤细胞和受感染的靶细胞的功能，在机体对抗肿瘤和抗感染免疫中均发挥重要作用[7]。在原发性肝癌中，上述两种细胞的数量降低可导致肿瘤细胞处于免疫逃逸状态，不能被机体免疫系统识别杀伤，使病情进展。而活化的B细胞主要参与体液免疫，致敏后再次接触同一抗原接触时很快发生活化和分化，快速产生高水平特异性抗体，且维持时间长。在原发性肝癌中B细胞的水平和功能降低可能造成针对肝癌细胞的特异性抗体水平降低，亦不能杀伤肿瘤细胞，进一步导致病情进展。

目前针对恶性肿瘤的治疗主要包括手术、化疗、放疗、生物治疗等综合治疗手段。虽然既往的研究发现手术[2]和TACE介入治疗[8]可部分恢复原发性肝癌患者的细胞免疫功能，但本研究发现，单纯介入治疗4周后原发性肝癌患者外周血免疫细胞的比例较治疗前未见明显升高。这可能与介入治疗中使用局部化疗药物灌注，导致骨髓抑制有关。在中医理论中，肝癌患者

属于“癥积”范畴，治疗上应扶正祛邪。既往的研究发现，重要联合TACE介入治疗可提高肝癌面者的细胞免疫功能[8-9]。复方斑蝥胶囊的组方中含有斑蝥、人参、黄芪、女贞子等，具有破血消瘀、攻毒蚀疮的功效，以扶正祛邪、益气活血、清热解毒为治法[10]。本研究发现，原发性肝癌患者介入治疗后联合复方斑蝥胶囊口服4周，外周血中CD8+T细胞和NK细胞的比例明显升高，说明受抑制的细胞免疫功能逐渐恢复，机体免疫力提高，CD8+T细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能恢复，可进一步提升介入治疗的效果，增强机体抗肿瘤的能力。但患者B细胞的数量与治疗前比较未见明显提高，可能与服药时间尚短，机体体液免疫功能尚未完全恢复有关。

[1] Mognol GP, Spreafico R, Wong V,etal. Exhaustion-associated regulatory regions in CD8+tumor-infiltrating T cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(13): E2776-E2785.

[2] 张 毅, 黄建钊, 石承先, 等. 复方斑蝥胶囊对老年肝癌患者术后T细胞免疫功能的影响[J]. 山东医药, 2008, 48(27): 89-90.

[3] Granier C, De Guillebon E, Blanc C,etal. Mechanisms of action and rationale for the use of checkpoint inhibitors in cancer[J]. ESMO Open, 2017, 2(2): e000213.

[4] Zheng C, Zheng L, Yoo JK,etal. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing[J].Cell, 2017, 169(7):1342-1356.

[5] Wieland D, Hofmann M, Thimme R.Overcoming CD8+ T-Cell Exhaustion in Viral Hepatitis: Lessons from the Mouse Model and Clinical Perspectives[J].Dig Dis, 2017, 35(4):334-338.

[6] Okoye IS, Houghton M, Tyrrell L,etal. Coinhibitory Receptor Expression and Immune Checkpoint Blockade: Maintaining a Balance in CD8+ T Cell Responses to Chronic Viral Infections and Cancer[J].Front Immunol, 2017, 8:1215.

[7] O'Sullivan TE, Sun JC, Lanier LL.Natural Killer Cell Memory[J].Immunity, 2015, 43(4):634-645.

[8] 殷 飞,李进军,曹 凤, 等. 复方斑蝥胶囊对肝癌患者TACE治疗前后细胞免疫功能的影响[J]. 世界华人消化杂志, 2011, 19(17): 1843-1846.

[9] 吕瑞民, 王静滨, 韩雪燕, 等. 中药联合TACE疗法对原发性肝癌免疫功能的影响[J]. 中医药信息, 2010, 27(6): 33-35.

[10] 夏环玲 .复方斑蝥胶囊联合放化疗治疗晚期食管癌的疗效观察[J].中国肿瘤临床与康复， 2012，19(2)： 167-168.