参芪止疱颗粒抗HSV-2的体外实验研究*

候亚林，杜立行，欧柏生，孙亚如，黄 涛，黄 彦，王 艺

1.广西中医药大学(南宁 530001)，2. 南宁市第十人民医院(南宁 530105)，3.广西中医药大学第一附属医院皮肤科(南宁 530023)

生殖器单纯疱疹病毒(Herpes simplex viruses type 2，HSV-2) 主要通过性接触传播感染人类，引起人类生殖器疱疹(Genital herpes，GH)。HSV-2阳性患者易合并梅毒苍白螺旋体感染，且易并发各种泌尿生殖系统感染，增加了疾病的治疗难度，给性传播疾病的预防和控制带来一定的负面影响[1]。目前认为，生殖器疱疹是一种尚不能彻底根治的病毒感染性性病。西医治疗本病的主要药物有阿昔洛韦和法昔洛韦等抗病毒药，这些药物虽对减轻发作症状、减少病毒排放、缩短病程有一定作用，但都难以达到彻底根治的目的，且存在耐药问题[2-3 ]。参芪止疱颗粒是欧柏生教授用于治疗生殖器疱疹的一个有效方剂，临床研究[4]证实其在抗生殖器疱疹复发方面具有疗效，且能提高机体免疫力。为进一步探讨参芪止疱颗粒抗HSV-2的作用机制，我们进行了相关的体外实验。

材料与方法

1 材 料

1.1 细胞:经培养、分离、鉴定无污染的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblast，HFF)，HFF常规培养传代,以上均由湖南中医药大学医学院伍参荣教授实验组完成。

1.2 病毒：HSV-2，由广州博特生物技术公司提供。HSV-2经HFF活化增殖，收获病毒作为毒种。

1.3 药物：参芪止疱颗粒(药物组成：太子参、知母、黄柏各12g，黄芪、白花蛇舌草、大青叶、板蓝根、鱼腥草、丝瓜络、薏苡仁各30g，柴胡8g，甘草3g)，采用培力(南宁)药业有限公司生产的农本方免煎配方颗粒剂,由广西中医药大学第一附属医院药房提供，用无菌蒸馏水溶解成1g/ml浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。阿昔洛韦片(Acyclovir，ACV，国药准字H19994080，南京瑞尔医药有限公司生产，批号：201304112021，规格：0.1g/片)，用DMEM培养液初溶，超声15min药粉充分溶解，然后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，配成40mg/ml浓度的药物母液。以上溶液均 4℃保存，实验时用DMEM维持液稀成所需浓度。

1.4 试剂及仪器：四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，胎牛血清(FBS)，均购自Sigma;含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰酶细胞消化液，GIBCO公司产品；DMEM培养液，北京鼎国生物技术有限公司产品；Thermo Fisher Scientific 细胞培养箱，美国赛默飞世尔科技公司；酶联免疫仪，Genios pro，Setifl number， 601000003，芬兰；倒置显微镜，Nikon，Ecllipss Tsl00，日本。

2 方 法

2.1 病毒毒力测定：将对数生长期的HFF用EDAT的0.25%胰蛋白酶消化，用完全培养基配成细胞密度为l×105个/ml单细胞悬液，接种至96孔细胞培养板，每孔1×104个细胞，37℃，5%CO2培养，细胞长满单层进行实验。HSV-2原液分别用培养基依次10倍稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-66个稀释度。96孔板中的HFF单层用PBS冲洗2次，然后将上述制备好的各稀释度病毒悬液接种于HFF单层，每孔100μl，各设5个复孔，并设正常细胞对照孔，37℃孵育2h后吸取出病毒液，加入新的细胞培养液，200ul/孔，置于37℃培养箱培养，每天观察记录细胞病变(Inhibitation of cytopathic effect，CPE)情况，用Reed-Muench法计算病毒的致半数细胞病变的滴度(Tissue culture infectious dose,TCID50)。CPE程度判定标准:(-)示细胞无病变,(+)示25%的细胞出现病变,()示25%～50%的细胞出现病变,()示50%～75%细胞出现病变,()示75%～100%细胞出现病变。

2.2 药物毒性测定：参芪止疱颗粒、ACV用DMEM培养液分别稀释为6个浓度(参芪止疱颗粒为10mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.63 mg/ml、0.32 mg/ml；ACV为5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.25 mg/ml、0.63 mg/ml、0.31 mg/ml、0.16mg/ml)。将HFF接种至96孔细胞培养板，待细胞长成单层后，将稀释好的各浓度药物加入到已长成细胞单层的96孔细胞培养板200μl/孔，每浓度做5个复孔，同时设正常细胞对照孔，37℃，5%CO2培养箱中培养，每天观察记录HFF的形态变化和生长情况，培养3d后，吸出孔内液体，PBS洗两遍，加入MTT液20μl，37℃，5%CO2继续培养4 h后，加入DMSO液200 μl/孔，充分振荡溶解孔内结晶，用酶联免疫仪测定570 nm处吸光度值[5]，计算细胞存活率和细胞的半数毒性浓度(50%cytotoxity concentration，CC50)。

2.3 药物直接抑制病毒复制作用测定：将参芪止疱颗粒、ACV分别自最大无毒浓度倍比稀释6个浓度，各浓度药液分别加入100TCID50病毒液l00 μL混合后，再将药物病毒液加入96板HFF单层上，每一浓度设5个复孔，设正常细胞对照组、病毒对照组及阳性药ACV对照组，37℃ 5%CO2培养72 h，终止培养，MTT法测得各组吸光度值,具体方法同方法2中步骤，并计算病毒抑制率、半数抑制病毒有效浓度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)和治疗指数(Therapeutic index，TI) 。

2.4 药物对病毒感染细胞的治疗作用：长满96孔单层细胞去培养液，PBS洗涤2次。各孔加病毒液100μl,37℃吸附2 h后吸出，用PBS洗去病毒残留液，加入不同浓度含药维持液100μl/孔，37℃ 5%CO2培养72h。MTT法测得各组吸光度值，具体方法同方法2中步骤，并计算药物对病毒抑制率、EC50和 TI。

2.5 药物预防病毒感染细胞作用：长满单层的HFF先加入不同浓度含药细胞维持液，37℃， 5%CO22 h，弃去含药细胞维持液，PBS洗去孔内残留的药液，加100TCID50HSV-2作用细胞，37℃ 5%CO2，2 h，弃去残留病毒液，加入细胞生长维持液，置37℃，5%CO272 h，MTT法测得各组吸光度值，具体方法同方法2中步骤，并计算药物对病毒生长抑制率。

2.6 药物对病毒复制抑制的时相作用：在HSV-2感染细胞的不同时间点即：0 h，2 h，4 h，6 h，8 h,10 h加入含2.5mg/ml参芪止疱颗粒细胞维持液，100μl/孔，37℃ 5%CO2培养，MTT法测得各组吸光度值，具体方法同方法2中步骤，检测药物对病毒复制的抑制作用。

3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行数据统计。数据分析用单因素方差分析方法进行，先进行方差齐性检验，若方差齐，则应用One．way ANOVA进行整体方差分析，用LSD方法进行组间多重比较，若方差不齐，则应用Welch法进行整体方差分析，用DunnettT3方法进行组间多重比较；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 病毒毒力 生物光学倒置显微镜下，正常HFF呈梭形，细胞膜界限清晰，胞浆透明度好，细胞形态完整，见图1中1；病毒所致的细胞病变表现为细胞变圆、肿胀、可见多核巨细胞或融合细胞(图1中2-7)。用Reed-Muench计算病毒的TCID50为10-4。

图1 生物倒置显微镜下不同稀释倍数的HSV-2致HFF细胞病变观察(20×10)

2 药物毒力 参芪止疱颗粒在10 mg/ml浓度时细胞存活率仍有73.52%，说明其对HFF的CC50值大于10 mg/ml，表明参芪止疱颗粒对HFF 的毒性作用小。ACV在0.63 mg/ml时细胞存活率为51.14%，ACV在0.31 mg/ml时细胞存活率为64.84%,最大无毒浓度为0.16 mg/ml。

3 药物直接抑制病毒复制作用 参芪止疱颗粒液、ACV各浓度对病毒具有抑制作用，且药物浓度越大，抑制作用越明显，与病毒对照组比较均具有统计学意义(P<0.05)。计算参芪止疱颗粒液的EC50值为0.30 mg/ml，TI>36，表明其对HSV-2感染HFF具有一定保护作用。阳性对照药ACV对HSV-2感染HFF显示出良好的保护作用，其EC50为0.018 mg/ml，TI值为67。

4 药物对病毒感染细胞的治疗作用 参芪止疱颗粒液、ACV各浓度的病毒抑制率与病毒对照组比较，差别均有统计学意义(P<0．05)，且有明显的量效关系。经计算参芪止疱颗粒液的EC50值为0.60 mg/ml，TI>25。结果提示参芪止疱颗粒液对病毒感染后病毒的复制有一定的治疗作用。

5 药物预防病毒感染细胞作用 参芪止疱颗粒在5mg/ml时，病毒抑制率不超过50%(仅38.94%)，表明参芪止疱颗粒不能阻断HSV-2病毒入侵细胞。提示参芪止疱颗粒对HSV-2感染细胞无预防作用。

6 药物不同时间点对病毒复制的影响 病毒感染HFF后各个时间点药物组最后测得的吸光度值与病毒对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。HSV-2感染细胞0 h，2 h后加入药物病毒增殖抑制率达到68.65%、73.26%；感染4 h，6 h后加入药物，病毒增殖抑制率分别达到59.32%，40.70%；但病毒感染细胞后8 h再加入药物进行干预，药物对病毒复制抑制作用则明显减弱，随着病毒进入细胞的时间延长，药物对病毒的复制的抑制效果也随之下降，10 h时病毒增殖抑制率仅为4.65%。提示参芪止疱颗粒液对HSV-2的抑制作用主要在病毒感染细胞的早期，可能在病毒DAN合成期。

讨 论

生殖器疱疹是主要由HSV-2引起的性传播疾病，以生殖器和肛周出现群集性水疱和浅表溃疡为主要临床表现。生殖器疱疹可引起胎儿感染和新生儿疱疹，在艾滋病流行地区，生殖器疱疹增加了HIV 感染的危险性，女性生殖器疱疹还与宫颈癌的发生密切相关，由于疱疹反复发作，部分患者可发生抑郁症，严重影响患者的身心健康和生活质量[6-7]。病毒细胞内复制是复杂但又程序化的过程即：吸附、穿入、脱衣壳、DNA复制、转录、翻译、蛋白质合成、核衣壳组装和病毒的释放等许多个环节，HSV-2也是如此，因此影响上述复制循环中任一环节的药物，均可能具有抗HSV作用[8]。目前核苷类是抗HSV的有效药物，其中无环鸟苷的分子基础是作用于病毒复制的关键环节，抑制HSV-2 DNA复制而不抑制细胞DNA的合成，而且其临床应用中耐药的情况很常见，同时又有一定的肾毒性，因此如何在中草药中寻找高效的抗HSV-2药物势在必行。参芪止疱颗粒方中黄芪、白花蛇舌草、板蓝根和大青叶都有抑制病毒的作用，方中部分中药具有广谱抗病毒作用，促进机体诱生干扰素，从而达到抑制病毒复制,延缓复发的作用[9]。本实验研究表明，与细胞对照组比较，参芪止疱颗粒对HFF毒性作用小；其对HSV-2感染HFF具有一定保护作用；对病毒的复制具有一定的抑制作用；对HSV-2病毒吸附入侵细胞没有阻断作用；其对HSV-2复制的抑制作用时相主要在感染后0 h、2 h、4 h，是在病毒复制周期的生物合成阶段，可能在DNA复制阶段，与刘建国[10]结果类似。表明参芪止疱颗粒是一种有效的抗HSV-2感染的方剂，其疗效机制值得进一步研究。

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