柴胡皂苷d-黄芩苷配伍对CCl4诱导大鼠HSC 的TLR4-NF-κB通路作用研究*

李 敏，高 凯，王华林，王義雯，李 静，王 斌

陕西中医药大学药学院(咸阳 712046)

肝纤维化是各种急慢性肝病常见的病理改变，其病理机制是肝脏中HSC持续激活转换成为肌成纤维样细胞，增殖合成细胞外基质(Extracellular matrixc,ECM)并过度沉积产生肝纤维化[1]。课题组研究表明，柴胡、黄芩配伍水煎液对大鼠肝纤维化模型及CCl4损伤L02细胞有良好的改善作用[2]，作用机制与TLR4-NF-κB信号通路有一定关联[3]。本研究探讨柴胡、黄芩中有效成分柴胡皂苷d-黄芩苷对CCl4诱导的HSC作用，进一步从TLR4-NF-κB信号通路的角度阐释其抗肝纤维可能的作用机制。

材料与方法

1 试剂与仪器 大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)，购自灏洋生物公司；1640培养基、TLR4、NF-κB一抗、二抗购自博士德生物科技公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；胰酶，购自Trypsin。TAK-242购自Invivo Gen 公司，BYA 11-7082购自江苏碧云天生物科技公司；HA、LN、PCIII、IV-C试剂盒购自北京永辉生物科技有限公司。

CO2培养箱、双人型超净工作台(新加坡ESCO)；倒置显微镜(奥特BDS200)；酶标仪(美国BioTek ELx808)；离心机(湘仪L530)。

2 实验药品

2.1 柴胡皂苷d、黄芩皂苷购自陕西中鑫生物技术有限公司，参考文献[5-6]及预实验结果，柴胡皂苷d和黄芩皂苷以1∶2.5的比例溶于DMSO中，以下简称SB。

2.2 CCl4溶液的制备:CCl4与DMSO各100 ml混匀，无血清培养基稀释至6 mmol/L。

3 HSC-T6培养及药物处理 HSC-T6于1640培养基，37℃、5% CO2培养箱培养传代。至对数生长期时，在无血清培养基中培养24 h后，1.5×106个/ml浓度接种过夜。实验分空白对照组( 无药物处理) ，CCl4诱导组(6mmol/L CCl4作用 6 h)，给药组(6mmol/L CCl4作用 6 h后，再用2.5、5、10 μg/ml的SB作用24 h)，TAK-242、BYA 11-7082组(6mmol/LCCL4作用 6 h后，再用TAK-242 10 mol/L、BYA 11-7082 2 mol/L作用24 h)。

4 SB对CCl4诱导的HSC细胞增殖的影响 MTT法检测大鼠HSC增殖抑制率。细胞抑制率=[1-(实验组A值/对照组A值)]×100%。

5 SB对CCl4诱导的HSC分泌HA、LN、PCIII、HA的影响 培养24 h后，收集细胞培养液，参照试剂盒使用说明书，应用Elisa法检测HA、LN、PCIII、HA含量。

6 SB对CCl4诱导的HSC的TLR4和NF-κBp65的mRNA水平的影响 培养24 h后，收集细胞，抽提细胞总RNA，通过RT-PCR的方法，检测的TLR4和NF-κBp65mRNA表达，PCR使用引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

7 SB对CCl4诱导的HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表达的影响 培养24h后，胰酶消化收集，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂裂解，离心，取上清，蛋白定量，细胞总蛋白加上样缓冲液煮沸变性。用 10% SBS-PAGE 分离蛋白，转膜后5% 脱脂牛奶室温封闭 2 h，一抗4 ℃ 过夜，二抗室温 2 h，洗膜后，加ECL 发光液，曝光。TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平用目的条带积分吸光度值(Integrated absorbance，IA) 与内参GAPDH蛋白条带的 IA 比值定量表示。

结 果

1 SB对CCl4诱导的HSC增殖的影响 与空白对照组比较，CCl4干预后，显著促进HSC细胞增殖(P<0.01)，SB对HSC细胞增殖具有显著抑制作用，剂量为10 μg/ml时，作用最明显；TAK-242 和BYA-11 7082也对HSC细胞增殖具有显著抑制作用。结果见表2。

表2 对CCl4诱导的HSC 增殖的影响

注：与CCl4干预组比较，**P<0.01，*P<0.05

2 SB对CCl4诱导的HSC分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影响 与空白对照组比较，CCl4干预后，细胞培养液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明显升高，SB、TAK-242 和BYA-11 7082对HA、LN、PCIII、IV-C分泌具有显著抑制作用。结果见表3。

表3 SB对经CCl4诱导的HSC-T6分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影响

注：与CCl4干预组比较，**P<0.01，*P<0.05

3 RT-PCR检测HSC中TLR4和NF-κBp65 mRNA表达 与空白对照组比较，CCl4干预后，TLR4和NF-κBp65 mRNA表达增强，SB、TAK-242 和BYA-11 7082则对TLR4和NF-κBp65 mRNA表达有下调作用，其中SB 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表4。

表4 SB对CCl4干预后HSC的TLR4NF-κB基因表达的影响

注：与CCl4组比较，*P<0.05

4 Western Blot法检测HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表达 与空白对照组比较，CCl4干预后，TLR4和NF-κBp65蛋白表达增强，SB、TAK-242 和BYA-11 7082对 HSC细胞TLR4和NF-κBp65 蛋白表达有下调作用，其中SSB- 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082组差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表5。

表5 CQ对CCl4干预后HSC的TLR4、NF-κB蛋白表达的影响

注：与CCl4组比较，*P<0.05，**P<0.01

讨 论

HSC在多种因素刺激后转换成为肌成纤维样细胞，大量增殖合成ECM，在肝内过量沉积导致肝纤维化。研究发现，TLR4激活后可调控下游NF-κB，导致炎性介质大量释放，造成肝脏损害[4-5]。可见，TLR4-NFκB信号通路异常与HSC异常增殖导致的肝纤维化密切相关[6]。文献[7-8]及课题组研究发现，柴胡黄芩配可明显防治大鼠肝纤维化，其作用机制可能与TLR4 -NFκB信号通路调控的炎症反应有关[2]。柴胡皂苷d、黄芩苷为柴胡、黄芩的主要活性成分，两者均有良好的抗肝纤维化作用[9-10]，本实验研究柴胡皂苷d、黄芩苷对CCL4诱导活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κBp65基因及蛋白表达的影响，探讨其抗肝纤维可能的作用机制。

结果表明，CCl4干预后，HSC大量增殖，其培养液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明显高于空白对照组(P<0.05)。可见，CCl4促进HSC增殖，并导致HA、LN、PCIII、IV-C分泌增加，促进肝纤维化。SB干预后，HSC增殖受到抑制，且HA、LN、PCIII、IV-C含量也降低，可见，SB有一定抗肝纤维化作用。同时，CCl4干预HSC后，细胞中TLR4和NF-κBp65 mRNA和蛋白表达均明显增加，SB干预后，两者mRNA表达和蛋白表达均明显降低，其中SB 10 μg/ml时(P<0.05)作用最为显著；应用TLR4的拮抗剂ATK-242，TLR4和NF-κBp65 mRNA表达和蛋白表达明显降低，应用NF-κBp65拮抗剂BAY 11-7082后，NF-κBp65 mRNA表达和蛋白表达也明显降低，TLR4 mRNA表达和蛋白表达没有明显变化。可见，SB表现出一定抗肝纤维化作用，其作用机制之一是可能是通过调控TLR4-NF-κB信号通路，具体的调控机制，尚需深入研究。

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