APP下载

柴胡皂苷d-黄芩苷配伍对CCl4诱导大鼠HSC 的TLR4-NF-κB通路作用研究*

2018-01-18王华林王義雯

陕西中医 2018年1期
关键词:柴胡皂苷黄芩柴胡

李 敏,高 凯,王华林,王義雯,李 静,王 斌

陕西中医药大学药学院(咸阳 712046)

肝纤维化是各种急慢性肝病常见的病理改变,其病理机制是肝脏中HSC持续激活转换成为肌成纤维样细胞,增殖合成细胞外基质(Extracellular matrixc,ECM)并过度沉积产生肝纤维化[1]。课题组研究表明,柴胡、黄芩配伍水煎液对大鼠肝纤维化模型及CCl4损伤L02细胞有良好的改善作用[2],作用机制与TLR4-NF-κB信号通路有一定关联[3]。本研究探讨柴胡、黄芩中有效成分柴胡皂苷d-黄芩苷对CCl4诱导的HSC作用,进一步从TLR4-NF-κB信号通路的角度阐释其抗肝纤维可能的作用机制。

材料与方法

1 试剂与仪器 大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),购自灏洋生物公司;1640培养基、TLR4、NF-κB一抗、二抗购自博士德生物科技公司;胎牛血清,购自Hyclone公司;胰酶,购自Trypsin。TAK-242购自Invivo Gen 公司,BYA 11-7082购自江苏碧云天生物科技公司;HA、LN、PCIII、IV-C试剂盒购自北京永辉生物科技有限公司。

CO2培养箱、双人型超净工作台(新加坡ESCO);倒置显微镜(奥特BDS200);酶标仪(美国BioTek ELx808);离心机(湘仪L530)。

2 实验药品

2.1 柴胡皂苷d、黄芩皂苷购自陕西中鑫生物技术有限公司,参考文献[5-6]及预实验结果,柴胡皂苷d和黄芩皂苷以1∶2.5的比例溶于DMSO中,以下简称SB。

2.2 CCl4溶液的制备:CCl4与DMSO各100 ml混匀,无血清培养基稀释至6 mmol/L。

3 HSC-T6培养及药物处理 HSC-T6于1640培养基,37℃、5% CO2培养箱培养传代。至对数生长期时,在无血清培养基中培养24 h后,1.5×106个/ml浓度接种过夜。实验分空白对照组( 无药物处理) ,CCl4诱导组(6mmol/L CCl4作用 6 h),给药组(6mmol/L CCl4作用 6 h后,再用2.5、5、10 μg/ml的SB作用24 h),TAK-242、BYA 11-7082组(6mmol/LCCL4作用 6 h后,再用TAK-242 10 mol/L、BYA 11-7082 2 mol/L作用24 h)。

4 SB对CCl4诱导的HSC细胞增殖的影响 MTT法检测大鼠HSC增殖抑制率。细胞抑制率=[1-(实验组A值/对照组A值)]×100%。

5 SB对CCl4诱导的HSC分泌HA、LN、PCIII、HA的影响 培养24 h后,收集细胞培养液,参照试剂盒使用说明书,应用Elisa法检测HA、LN、PCIII、HA含量。

6 SB对CCl4诱导的HSC的TLR4和NF-κBp65的mRNA水平的影响 培养24 h后,收集细胞,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法,检测的TLR4和NF-κBp65mRNA表达,PCR使用引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

7 SB对CCl4诱导的HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表达的影响 培养24h后,胰酶消化收集,加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂裂解,离心,取上清,蛋白定量,细胞总蛋白加上样缓冲液煮沸变性。用 10% SBS-PAGE 分离蛋白,转膜后5% 脱脂牛奶室温封闭 2 h,一抗4 ℃ 过夜,二抗室温 2 h,洗膜后,加ECL 发光液,曝光。TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平用目的条带积分吸光度值(Integrated absorbance,IA) 与内参GAPDH蛋白条带的 IA 比值定量表示。

结 果

1 SB对CCl4诱导的HSC增殖的影响 与空白对照组比较,CCl4干预后,显著促进HSC细胞增殖(P<0.01),SB对HSC细胞增殖具有显著抑制作用,剂量为10 μg/ml时,作用最明显;TAK-242 和BYA-11 7082也对HSC细胞增殖具有显著抑制作用。结果见表2。

表2 对CCl4诱导的HSC 增殖的影响

注:与CCl4干预组比较,**P<0.01,*P<0.05

2 SB对CCl4诱导的HSC分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影响 与空白对照组比较,CCl4干预后,细胞培养液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明显升高,SB、TAK-242 和BYA-11 7082对HA、LN、PCIII、IV-C分泌具有显著抑制作用。结果见表3。

表3 SB对经CCl4诱导的HSC-T6分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影响

注:与CCl4干预组比较,**P<0.01,*P<0.05

3 RT-PCR检测HSC中TLR4和NF-κBp65 mRNA表达 与空白对照组比较,CCl4干预后,TLR4和NF-κBp65 mRNA表达增强,SB、TAK-242 和BYA-11 7082则对TLR4和NF-κBp65 mRNA表达有下调作用,其中SB 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082差异有统计学意义(P<0.05),结果见表4。

表4 SB对CCl4干预后HSC的TLR4NF-κB基因表达的影响

注:与CCl4组比较,*P<0.05

4 Western Blot法检测HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表达 与空白对照组比较,CCl4干预后,TLR4和NF-κBp65蛋白表达增强,SB、TAK-242 和BYA-11 7082对 HSC细胞TLR4和NF-κBp65 蛋白表达有下调作用,其中SSB- 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082组差异有统计学意义(P<0.05),结果见表5。

表5 CQ对CCl4干预后HSC的TLR4、NF-κB蛋白表达的影响

注:与CCl4组比较,*P<0.05,**P<0.01

讨 论

HSC在多种因素刺激后转换成为肌成纤维样细胞,大量增殖合成ECM,在肝内过量沉积导致肝纤维化。研究发现,TLR4激活后可调控下游NF-κB,导致炎性介质大量释放,造成肝脏损害[4-5]。可见,TLR4-NFκB信号通路异常与HSC异常增殖导致的肝纤维化密切相关[6]。文献[7-8]及课题组研究发现,柴胡黄芩配可明显防治大鼠肝纤维化,其作用机制可能与TLR4 -NFκB信号通路调控的炎症反应有关[2]。柴胡皂苷d、黄芩苷为柴胡、黄芩的主要活性成分,两者均有良好的抗肝纤维化作用[9-10],本实验研究柴胡皂苷d、黄芩苷对CCL4诱导活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κBp65基因及蛋白表达的影响,探讨其抗肝纤维可能的作用机制。

结果表明,CCl4干预后,HSC大量增殖,其培养液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明显高于空白对照组(P<0.05)。可见,CCl4促进HSC增殖,并导致HA、LN、PCIII、IV-C分泌增加,促进肝纤维化。SB干预后,HSC增殖受到抑制,且HA、LN、PCIII、IV-C含量也降低,可见,SB有一定抗肝纤维化作用。同时,CCl4干预HSC后,细胞中TLR4和NF-κBp65 mRNA和蛋白表达均明显增加,SB干预后,两者mRNA表达和蛋白表达均明显降低,其中SB 10 μg/ml时(P<0.05)作用最为显著;应用TLR4的拮抗剂ATK-242,TLR4和NF-κBp65 mRNA表达和蛋白表达明显降低,应用NF-κBp65拮抗剂BAY 11-7082后,NF-κBp65 mRNA表达和蛋白表达也明显降低,TLR4 mRNA表达和蛋白表达没有明显变化。可见,SB表现出一定抗肝纤维化作用,其作用机制之一是可能是通过调控TLR4-NF-κB信号通路,具体的调控机制,尚需深入研究。

[1] Sahin H,Trautwein C,Wasmuth H E.TLR4 stresses the liver[J].Gut,2012,61:1241-1242.

[2] 王 斌,李 敏,侯建平.基于TLR4 -NFκB信号通路的柴胡-黄芩药对抗肝纤维研究[J].中药药理与临床,2015,31(3):103-106.

[3] 李小菲,李 静,王義雯,等.柴胡、柴胡和黄芩配伍对肝细胞损伤体外作用[J]. 吉林中医药,2016,36(2):176-180.

[4] Zhu Q,Zou L,Jagavelu K,etal.Intestinal decontaminationinhibits TLR4 dependent fibronectin-mediated cross-talk between stellate cells and endothelial cells in liver fibrosis inmice[J].Hepatol,2012,56(4)∶893-899.

[5] Min Yu,Danbing Shao,Jian Liu,etal.Effects of ketamine on levels of cytokines,NF-κB and TLRs in rat intestine during CLP-induced sepsis[J].International Immunopharmacology,2007,7 (8):1076-1082.

[6] 李 冬,戴立里,余斌斌,等.丹参素对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影响[J]. 第三军医大学学报,2009,31(8):724-727.

[7] 郑丽娜,韩 涛,王宝恩,等.柴胡对肝星状细胞胶原蛋白分泌的影响[J]. 天津医科大学学报,2001,7(4):502-503.

[8] 刘林华,许景薇,万玉英,等.猪牙皂正丁醇提取物体外对肝星状细胞活性的影响研究[J].抗感染药学,2015,12(6):832-834.

[9] 郭景珍,万 方,李 忻,等.柴胡皂苷d 对二甲基亚硝胺致肝纤维化大鼠炎症相关因子的影响[J].中华中医药杂志,2008,23(11):970-972.

[10] 刘志勇,叶 军,薛东英.黄芩苷对肝纤维化大鼠相关细胞因子表达的影响[J].中国当代医药,2013 ,20(12) :18-21.

猜你喜欢

柴胡皂苷黄芩柴胡
柴胡总皂苷的大鼠体内代谢特征谱研究
黄芩的高产栽培技术
张永新:种植黄芩迷上了“茶”
核桃柴胡间作技术
黄芩使用有讲究
HPLC法同时测定柴胡桂枝汤中6种成分
柴胡汤类方剂用于肝恶性肿瘤治疗进展
HPLC-CAD法测定不同产地柴胡药材中柴胡皂苷
黄芩苷脉冲片的制备
一测多评法同时测定消癥微丸中4种柴胡皂苷