烟粉虱对吡虫啉的室内抗性发展动态及其生化机制

郑 宇,姚凤銮,丁雪玲,赵建伟,何玉仙

(福建省农业科学院 植物保护研究所/福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建 福州 350013)

烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一种世界性害虫,给农业生产造成了极大的损失[1]。烟粉虱的防治一直以化学防治为主,由此也引发了包括抗药性在内的一系列问题。近年来,烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗药性也十分普遍[2-4]。我们通过抗性监测证实福建田间烟粉虱群体对新烟碱类杀虫剂的敏感性普遍下降,部分地区达到了中高抗水平[5]。因此烟粉虱的抗药性成为治理的重点和难点[6]。本研究通过在室内对烟粉虱相对敏感品系进行吡虫啉药剂抗性的连续汰选,每隔一代进行烟粉虱对吡虫啉的敏感性测定,以了解其抗性发展动态;同时测定了烟粉虱相对敏感和抗性种群中羧酸酯酶CarE、谷胱甘肽转移酶GSTs、多功能氧化酶MFO活性的变化差异,以探讨其抗性形成的生化机理,为烟粉虱的抗药性治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及饲养

供试烟粉虱相对敏感品系(SS)于2011年采集于福州市郊,经mtCOI标记鉴定为B型烟粉虱。在福建省农业科学院植保所昆虫饲养室,以棉花为寄主继代饲养烟粉虱相对敏感品系,期间未接触任何杀虫剂,测定其LC50,为270 mg/L。

1.2 供试药剂

供试药剂:吡虫啉(10%可湿性粉剂,由沈阳化工研究院试验厂生产)、α-乙酸萘酯(α-NA,由中国上海青浦合成试剂厂提供)、固蓝RR盐(Fast Blue RRsalt,由厦门泰京生物技术有限公司提供)、碘化硫代乙酞胆碱(ATChI,由Fluka公司提供)、二硫代双对硝基苯甲酸(DTNB,由上海化学试剂厂提供)、还原型谷胧甘肤(GSH,由上海生工生物工程有限公司提供)、考马斯亮蓝(G-250,由中国医药集团上海化学试剂分公司提供);其他试剂均为分析纯。

1.3 生物测定方法

参照何玉仙等[4]的方法,采用棉叶浸叶法对烟粉虱进行毒力测定。

1.4 抗性种群汰选方法

采用灌根法对同源对照的烟粉虱相对敏感种群SS进行吡虫啉抗性选育。以每代烟粉虱的毒力测定结果(LC20)作为吡虫啉灌根浓度的参考,每盆棉花苗灌根50 mL吡虫啉溶液后,持续喂养,待每代种群个体被杀死40%～60%后,换入未灌根的棉花苗进行正常饲养，直至下一代。

1.5 酶液制备

挑取100头烟粉虱雌成虫放入1.5 mL的离心管中,加入1 mL磷酸钠缓冲液(0.02 mol/L、pH 7.0，含0.1% TritonX-100)进行匀浆,置于4 ℃静置30 min,在4 ℃下以10000 r/min离心10 min,吸取上清液作酶源。

1.6 蛋白质含量的测定

参照Braford[8]的方法,采用美国 Max190型酶标仪,在595 nm波长处测定酶源的OD值,重复5次,根据标准曲线计算出酶源的蛋白质含量。

1.7 羧酸酯酶CarE活性的测定

参照Graham[9]的方法,在96孔酶标板加入1×10-4mol/L毒扁豆碱溶液25 μL、酶粗提液25 μL,再加入200 μL 1 mmol/L α-NA和1.5 mmol/L固蓝RR盐混合液;在美国分子仪器公司生产的Max190型酶标仪上测定595 nm处的OD值,反应温度27 ℃,重复3次。空白对照以磷酸缓冲液代替。

1.8 谷胱甘肽转移酶GSTs活性的测定

参照Graham[9]的方法,在96孔酶标板加入30 μL 50 mmol/L GSH、230 μL 0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)、10 μL 30 mmol/L CDNB、25 μL酶粗提液(空白对照以磷酸缓冲液代替),轻微振荡混匀;在Max190酶标仪上,在340 nm处测定OD值,重复3次。

1.9 多功能氧化酶(MFO)活力的测定

采用Li[10]的方法，在96孔酶标板中加入样品,反应温度为30 ℃,在Max190型酶标仪405 nm波长下测定OD值,每隔25 s记录1次,共25次,重复3次。

1.10 数据处理

用DPS 7.0统计软件求出毒力回归方程的斜率、LC50及其95%置信限。抗性倍数=汰选烟粉虱种群的LC50值/相对敏感种群的LC50值。方差分析采用DPS软件中的邓肯氏新复极差检验法。

2 结果与分析

2.1 烟粉虱室内抗性发展动态

在室内吡虫啉药剂抗性汰选过程中,用浸叶法进行烟粉虱对吡虫啉敏感性的毒力测定。结果显示:相对敏感品系SS(LC50=270 mg/L)进行吡虫啉药剂连续筛选14代后,汰选所用吡虫啉亚致死剂量LC20从100 mg/L上升到1000 mg/L(表1);在抗性汰选的初期(初始6代),烟粉虱种群抗性增长较为缓慢,增长约1.64倍,与SS群体无显著差异。在第6代后抗性水平增长加快,到第8代抗性倍数达到3.16倍；随后抗性增长有所平缓,但到10代后抗性水平又迅速上升,到14代时LC50为2414 mg/L,抗性倍数为相对敏感种群的8.64倍,差异显著。从各代毒力回归线的斜率b值(表1)来看,b值由1.772逐渐降低为0.838,表明在吡虫啉亚致死剂量的选择压力下,烟粉虱相对敏感品系中抗性杂合子逐渐出现,群体异质性开始变大,抗性个体增多,导致抗性水平提高。

表1 吡虫啉汰选下室内烟粉虱不同代数的毒力测定结果

2.2 烟粉虱两种群3种解毒酶活性差异

2.2.1 羧酸酯酶CarE活性 由表2可见:烟粉虱两个种群(SS、RR)羧酸酯酶的活性差异显著,RR种群的CarE活性是SS种群的2.35倍。由此可见,羧酸酯酶活性的升高加强了对吡虫啉的代谢解毒作用,使烟粉虱对吡虫啉的抗性提高。

表2 羧酸酯酶CarE活性测定结果

2.2.2 谷胱甘肽转移酶GSTs活性 由表3可知:烟粉虱两个种群间谷胱甘肽转移酶GSTs的活性没有显著性差异。可以推测GSTs并未参与吡虫啉的代谢作用,所以GSTs对烟粉虱的吡虫啉抗性提高作用不明显。

表3 谷胱甘肽转移酶的活性测定结果

2.2.3 多功能氧化酶MFO活性 从表4可以看出，烟粉虱RR种群的MFO活性是SS种群的1.20倍。因此,可推断MFO活性的提高加快了烟粉虱机体对吡虫啉及其衍生产物的降解,这也是烟粉虱抗性水平上升的一个重要因素。

表4 多功能氧化酶MFO活性测定结果

3 讨论

害虫抗药性发展的速度除与自身的生物学特性有关外,还与药剂的特性、选择压力,以及害虫初始抗性频率有关。本研究利用浸叶法测得的吡虫啉亚致死剂量LC20进行灌根处理,对B型烟粉虱进行了连续14代抗性品系汰选，发现烟粉虱群体室内抗性动态变化表现出初期(1～6代)上升缓慢,中期(8～10代)增长加快,到后期(12～14代)增长更为迅速的特点。分析表明烟粉虱抗性发展初期比较缓慢,可能与其群体初始抗性频率比较低有关;而后期抗性增长较快与吡虫啉内吸性强,药剂残留期长,可对烟粉虱形成持续性压力,药剂的亚致死效应比较明显[10]相关。另外,与其他昆虫相比,烟粉虱群体繁殖力强,世代历期短,因而可以在更短的时间内使其群体的抗性频率得到提高,使种群表现出抗药性特征。以上因素很可能是烟粉虱对吡虫啉的抗性增加较为迅速的主要原因。因此,今后在对烟粉虱的防治中,应特别注意药剂的选择、药剂的轮换以及科学用药等,尽量减缓其抗药性水平的增加。

近年来研究表明昆虫的抗药性形成与代谢抗性的提高密切相关[10]。吡虫啉是新烟碱类杀虫剂的典型代表,由硝基亚甲基杂环结构和烟碱组合,其药效基团为硝基亚胺(N-NO2)。吡虫啉代谢研究在多种哺乳动物和植物中都有报道[10-11],在昆虫方面主要集中在家蝇(Muscadomestica)、蜜蜂(Apismellifera)、果蝇(Drosophilamelanogaster)、烟粉虱(Bemisiatabaci)等上[12-13]。研究发现吡虫啉在昆虫中主要发生羟基化、去饱和化、去烷基及硝基还原等代谢反应,通常这些代谢产物的生物活性有所降低,比本体毒性更低。因而推论昆虫体内相关代谢解毒酶的代谢作用减低了吡虫啉对昆虫自身的毒害。前人研究显示涉及介导昆虫代谢抗性的代谢酶有三大酶系:非专一性酯酶(ESTs)、谷胱甘肽S-转移酶系(GSTs)和多功能氧化酶系。为了加强烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性及机理研究,本研究还进行了3种代谢解毒酶CarE、GSTs和MFO活性的对比测定,发现抗性RR种群的CarE和MFO活性提高明显,而GSTs活性提高不显著。这说明CarE和MFO活性的提高极有可能加快了烟粉虱对吡虫啉的代谢降解作用,从而使烟粉虱对吡虫啉的敏感性下降,使其抗性水平大大提高；而GSTs与吡虫啉抗性形成关系不大。本试验结果为烟粉虱对吡虫啉的代谢抗性机理研究提供了一定的生化证据,但对代谢酶类、相关功能以及相关基因表达、调控研究还未进行。在本试验研究的基础上，今后有必要进一步研究烟粉虱抗性、敏感种群之间相关基因表达的差异,进行相关基因的克隆、生物信息学分析,以了解不同解毒酶的生理特性,揭示其代谢作用增强(涉及酶数量或质量上的改变)的分子机理。未来我们还可以借助基因沉默、敲除等分子生物学手段来研究代谢酶在昆虫体内的生理作用。同时,利用蛋白表达与纯化技术获得有活性的代谢酶,进而分析其酶学及生物学特性,为解毒酶介导的昆虫代谢抗性机理研究奠定基础。

[1] 万方浩,郭建英,张峰,等.中国生物入侵研究[M].北京：科学出版社,2009：157.

[2] Nauen R, Stumpf N, Elbert A. Toxicological and mechanistic studies on neonicotinoid cross resistance in Q-typeBemisiatabaci(Hemiptera: Aleyrodidae) [J]. Pest Manag Sci, 2002, 58: 868-875.

[3] 何玉仙,黄建.烟粉虱抗药性的研究进展[J].华东昆虫学报,2005,14(4):336-342.

[4] 郑宇,赵建伟,何玉仙,等.福建省烟粉虱田间种群抗药性发展及其影响因素[J].应用生态学报,2012,23(1):271-277.

[5] Yao F L, Zheng Y, Huang X Y, et al. Dynamics ofBemisiatabacibiotypes and insecticide resistance in Fujian province in China during 2005～2014 [J]. Scientific Reports, 2017(7).

[6] Jeschke P, Nauen R, Schindler M, et al. Overview of the status and global strategy for neonicotinoids [J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(7): 2897-2908.

[7] Bradford W. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilization the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem, 1976, 72: 248-254.

[8] Graham D, Gao X, Denholm L, et al. Characterization of insensitive acetyl- cholinesterase in insecticide resistant cotton aphids,Aphisgossypii[J]. Pestic Biochem Physiol, 1996, 56(2): 102-110.

[9] 唐振华,吴士雄.昆虫抗药性的遗传与进化[M].上海:上海科学技术文献出版社,2000.

[10] Li A G, Yang Y H, Wu S W, et al. Investigation of resistance mechanisms to fipronil in diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) [J]. J Econ Entomol, 2006, 99(3): 914-919.

[11] Ford K A, Casida J E. Chloropyridinyl neonicotinoid insecticides: diverse molecular substituents contribute to facile metabolism in mice [J]. Chem Res Toxicol, 2006, 19(7): 944-951.

[12] Casida J E. Neonicotinoid metabolism: compounds, substituents, pathways, enzymes, organisms, and relevance [J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(7): 2923-2931.

[13] Byrne F J, Castle S, Prabhaker N, et al. Biochemical study of resistance to imidacloprid in B biotypeBemisiatabacifrom Guatemala [J]. Pest Manag Sci, 2003, 59: 347-352.

[14] Suchail S, Debrauwer L, Belzunces L. Metabolism of imidacloprid inAphismellifera[J]. Pest Manag Sci, 2003, 60(3): 291-296.

[15] 范银君,史雪岩,高希武.新烟碱类杀虫剂吡虫啉和噻虫嗪的代谢研究进展[J].农药学学报,2012,14(6):587-596.