全烟气暴露试验技术进展

韩亚伟，张东鹏，黄丽萍，陈利平

（郑州轻工业学院烟草行业生物技术重点实验室，河南郑州 450002）

为了分析吸烟与某些疾病的联系，需要了解卷烟抽吸过程中发生的各种物理化学变化及抽烟过程中的复杂动态，以便确定一些与抽烟不利于健康有关的前兆和机制。近几十年来，随着理化分析技术的研究和发展，主流烟气中的大部分成分已经得到确定。烟气是一种复杂的、动态的气溶胶，包含了数以千计的化学成分，最新的研究数据显示，其中含有5 600余种化学成分，约158种物质具有毒理学效应，学术上称之为烟气毒物[1]。这些成分会导致某些疾病。例如，与慢性阻塞性肺病和肺中毒有关的醛类（甲醛、丙烯醛、乙醛）在卷烟烟气气相中多有存在；多环芳烃类（PAHs）、烟草特有亚硝胺类（TSNAs）、砷、镉和铬在卷烟烟气中均有发现，这些物质与多种癌症的发生有关。

1 全烟气暴露试验技术概述

以往的卷烟烟气毒理学研究方法比较侧重于用剑桥滤片捕获颗粒相，然后用DMSO溶解洗脱，或者直接以气泡的形式充入细胞培养基或PBS中，随后进行细胞培养，这样就相当于细胞在烟气颗粒相中进行暴露培养。不足的是，以颗粒相为主的暴露培养方案没有考虑到卷烟烟气的气相物质，以及颗粒相和气相之间的相互作用。浸入式的培养条件和基于烟气颗粒相的暴露，并不能完全从生理上模拟人类肺细胞在主流烟气下的暴露条件。此外，以这种方式分离的烟气可能会发生转化和化学变化，并不能充分代表全部烟气气溶胶的性质。为了尽可能模拟人类肺细胞在主流烟气下的暴露反应，研究人员发明了一种细胞全烟气暴露系统。目前，虽然全烟气暴露系统在技术上存在很多困难，但是它能收集烟气中的颗粒相和气相，能较为综合地反映烟气性质，是一种更加精确的生物学检测系统，代表着卷烟烟气生物学分析技术的发展方向[2]。全烟气暴露下，捕获的粒相与气相在一起充分反应，这种系统的另外一个优点是不同的细胞培养物可以在空气-液体界面条件下充分与全烟气接触，能够更好地模拟人体细胞在抽烟时的暴露环境。

目前，已经有各种各样的全烟气暴露系统，有已经商业化生产的，也有一些公司自行研制、开发、升级，仅供公司内部研究使用的。不管它们的类型，这些系统一般都有2个主要组成部分：①吸烟机，用于产生、稀释和输送烟气；②暴露室，通常是一个存在空气-液体界面的密闭空间，用来模拟人体环境，不同系统的设置参数不同，输入烟气量的大小也可以用多种方式表示。

2 全烟气暴露系统研究进展

传统的烟气暴露分析技术主要是基于收集卷烟烟气颗粒相，而忽略了气相和半挥发物质，这推动了全烟气暴露系统的发展。全烟气暴露系统还有一个优势，就是可以通过试验参数的设置，对卷烟烟气的各相进行统一或者独立的分析。这使研究人员可以像定制衣服一样，根据试验目的设置试验参数，有针对性地检测分析烟气各相，得到有用的信息。目前有各种各样的全烟气系统可以选择，其中大部分系统既可以向培养的细胞输送单一气溶胶，也可以输送复杂的气溶胶混合物，因此，这些系统可以应用于烟草以外的行业，但目前为止，关于烟气中化学成分检测分析技术的论文信息比较有限[3]。市场上可以购买的吸烟机型号有Borgwaldt RM20S，Burghart MSB-01和vitrocellR VC 10等。市售的暴露间或暴露模块与吸烟机相连接组成全烟气暴露系统，主要的系统类型有英美烟草公司研发的系统、汉诺威cultex实验室研发的系统和瓦尔德基希vitrocell实验室研发的系统。由于最初同属于一个研发团队，系统和系统的曝光模块之间有一些明显的相似之处，这个团队一直致力于全烟气体外毒理学检测技术的改进，经过7年（1999—2006） 在科学、技术和商业化运作上的合作与发展，此团队逐步壮大，最终一分为二，形成了今天的团队和团队。这也是为什么系统和系统之间有这么多的相似性和较好的相容性，也解释了近期发展中的多样性。

2.1 定制系统

定制的暴露系统常被用于卷烟烟气理化分析的基础性研究。虽然商用型号和定制系统之间没有太多可比之处，但这些根据目的而设计制作的独一无二的暴露装置成本低，占地面积不大，构造不那么复杂，并且更易于维护。举几个例子探讨如何使用定制的暴露系统得到有实际意义的生物学试验数据。

Scian M J等人[4]描述了一个具有空气-液体（ALI）界面的暴露系统，研究了2种香烟的混合主流烟气对大鼠支气管上皮细胞的影响。该暴露系统包括1个具有2个通风孔的“密封室”，其大小足以容纳一个细胞培养板，并安装有一个小风扇。细胞培养3 d，每天进行2次烟气暴露，分别在第1天和第3天收获部分细胞培养液，利用酶联免疫吸附试验检测MCP-1，IL-10，VEGF这3种蛋白的分泌量[4]。此外，圣劳伦特还进行了一个对比试验，将细胞置于融有卷烟烟气提取物（CSE） 的培养液中培养，将2项试验结果进行对比。结果表明，相对于CSE模型试验，细胞全烟气暴露过程中MCP-1蛋白的分泌被抑制，产生的IL-10蛋白减少，VEGF的分泌量基本相同。圣劳伦特指出，在CSE和ALI这2种暴露培养模式下，小鼠支气管上皮细胞蛋白质分泌量的不同，表明选择何种试验模型对所获得的数据有一定影响。此外，在使用不同卷烟烟气组分时，会有不同的细胞反应，这也表明不同的烟气组分在组织反应中具有独立的作用。

另一个例子中，菲利普斯等人将暴露室与一个简单的室内烟气发生器相连接，用以评估烟气对人支气管上皮细胞和卡他莫拉菌感染的天然免疫反应的影响。用泵将一支烟吸尽，将烟气抽入一只1 000 mL的烧瓶中，对细胞进行10 min的ALI暴露。结果表明，烟气增加了细菌数量，但抑制了前列腺素E2（PGE2） 的产生，PGE2已被证明具有免疫调节功能。菲利普斯指出，该试验结果有助于阐明PGE2在阻塞性肺气肿（COPD）患者的黏膜天然免疫反应中的作用。

在最后一个例子中，瓜莱尔齐等人用管子将一支香烟、一个注射器和一个无菌瓶连接起来，形成一个T形结构，结合处由一个阀门连接，从而制作出一个简单但独特的装置。无菌瓶中含有取自不抽烟的健康女人的角质化口腔黏膜细胞，处于半浸没条件，从而更好地模拟口腔生理环境[5]。在6 min内，用注射器抽入烟气，打开阀门，将烟气注入无菌瓶，然后取下无菌瓶，让烟气流出，使空气再循环，重复操作直到香烟抽尽。暴露后，利用组织化学和免疫荧光技术分析细胞间黏附的生物标志物。结果表明，对烟气的反应是从口腔上皮的基底层和基底上层开始的，在烟气暴露后3 h即出现了K14蛋白的高丰度表达。此外，这种装置模拟了口腔黏膜的三维特性，而且能够模拟吸气、呼气循环。

2.2 Borgwaldt系统

Borgwaldt RM20S是一种旋转式、注射器式机械吸烟机，能够同时抽吸8支香烟而且不会发生交叉污染。这种独立抽烟的设计8种不同的卷烟烟气稀释成同一浓度或将一种卷烟烟气稀释成8种浓度。因此，RM20S型吸烟机既可以用于烟草制品评价，还可以用于基础研究。首先，吸嘴吸一口烟气，然后充入过滤空气，达到稀释的目的，通常以烟气与空气的体积比率来反映稀释程度，高稀释度需要一个连续稀释的过程。将稀释过的烟气以0.8 L/min充入暴露室。每个吸嘴对应一个独立的暴露室，从而防止发生交叉污染。

尽管不是由同一公司生产，在设计上也不通用，但Borgwaldt RM20S型吸烟机几乎和英美烟草公司（BAT）的暴露室完全匹配，这种暴露室由汉普郡工程技术有限责任公司生产。关于这二者的结合使用，已经有一系列有关细胞体外研究进展和暴露系统性能的论文发表。菲利普斯等人率先使用RM20S型吸烟机和 BAT暴露室研究了支气管上皮细胞NCIH292暴露于卷烟烟气后的细胞反应。该项研究展示了细胞卷烟烟气暴露之后的一系列反应，如细胞毒性、颗粒沉积、mRNA和蛋白的表达[6]。蒙德斯等人对人类肺支气管上皮原代细胞进行烟气暴露后，使用基因芯片技术，围绕基因表达差异进行了更深入的研究。结果与先前体外、体内研究中关于烟气毒性的报道一致，如增加上皮细胞通透性、抗氧化反应和MAPK途径的增加。蒙德斯等人指出，细胞黏附效应的下调反应，可能导致了细胞通透性增加，有可能与卷烟烟气诱发性疾病有关。

对RM20S型吸烟机性能最早进行描述的是Kaur等人，他们对放在加拿大和英国2个位置的2台机器进行了比较。通过使用碳氢化合物分析仪，10%甲烷气体体积标准，对2个机器的稀释精度进行了评估。结果表明，虽然注射体积难免有些变化，但这2台机器的稀释精度是相似的（小于10%的相对标准偏差）。亚当森等人对RM20S型吸烟机的性能进行了更进一步的描述，测定了RM20S系统在暴露过程中的烟气的损失。赛安等人在系统的不同位置（抽烟后，暴露室前和暴露室后） 安装了电迁移率光谱仪。结果表明，主流烟气在细胞暴露室前约有48%的损失，在暴露室中约有16%的损失。

RM20S型吸烟机与BAT暴露室的组合的主要局限在于，迄今为止，它几乎只被英美烟草公司使用，使得其研究结果很难与使用其他暴露系统所做的研究结果进行直接比较。

2.3 Burghart系统

Burghart公司的MSB-01型吸烟机与其他商业化的烟气暴露系统有所不同，是一个多板层集成的系统，专为高通量的体外试验而设计。暴露板（96孔板）集成于暴露系统，因而提供了一种简单的暴露途径，避免了将各个独立的暴露模块组合在一起的麻烦。MSB-01型吸烟机的吸嘴被设计成独立的，这样就可以同时对多种类型香烟或者同种香烟不同剂量进行实验，稀释能力可达1∶150（烟气体积∶空气体积，V∶V）。一个烟气分流板通过2个孔道对细胞培养板进行持续暴露。从吸烟开始到细胞暴露于烟气，大概需要6 s。

赛安等人对MSB-01型吸烟机的性能进行了测试，包括多孔板中的颗粒沉积、烟气损失量、颗粒大小和细胞存活率。将曝光过程中沉积在培养板上的颗粒物溶解在DMSO中，用比色法测定量的大小；在系统各个位置捕获颗粒相物质，从而测定烟气的损失量；对支气管上皮细胞BEAS-2B进行烟气暴露，从而测定细胞毒性。这些分析结果，有助于更好地了解MSB-01系统的性能表现[7]。此外，MSB-01系统对香烟烟气的化学分析，有助于了解机器如何提供烟气，以及稀释度对颗粒物粒径和分布的影响。赛安等人的研究结果表明，MSB-01系统的烟气损失量与Borgwaldt RM20S系统相近，在40%～50%。

相比于其他烟气暴露系统，MSB-01系统可以满足高通量试验的需求。然而，这种系统的一个潜在缺陷是，它不支持对细胞进行ALI暴露，这限制了MSB-01系统在初级细胞学研究中的应用。

2.4 Vitrocell系统

VitrocellRVC 10型吸烟机是一种旋转式、单管道、连续稀释性吸烟机，由德国Vitrocell公司生产。VC 10型吸烟机的注射器将卷烟主流烟气输送到独立的连续流动稀释模块，它包含了4～5个稀释阀门。过滤空气垂直于烟气气流流动方向从稀释阀门的上方和下方充入，与烟气混合形成稀释烟气流，烟气稀释度通过增加或减小空气气流来实现。此外，由真空泵提供负压，将稀释过的烟气从稀释棒中吸到暴露模块里。

VC 10型吸烟机通常与Vitrocell或Cultex暴露模块联合使用，因为这2个模块的设计是互补的。暴露模块直接安装在连续流动稀释系统下面，细胞培养板分别暴露于从稀释棒抽出的稀释烟气中。此外，Vitrocell公司已经开发了几种暴露模块来适配该系统。例如，用于细胞转染试验的3孔或4孔哺乳动物细胞暴露模块，以及用于高通量暴露试验的24孔和96孔培养板。此外，Vitrocell公司还研发了用于Ames试验的细菌暴露模块。所有的暴露模块采用相同的“喇叭型”设计方案，这种设计思想与Cultex公司共享，将细胞直接暴露于烟气气溶胶中，使模块内具有更有效的扩散和沉积环境。

Okuwa等人使用VC 10系统，在多个吸烟条件下，将中国仓鼠肺细胞暴露于卷烟主流烟气中，分析了细胞微核效应。此外，他们比较了全烟气条件下与气相条件下试验结果的不同。有意思的是，Okuwa及其同事注意到，各个吸烟条件下，卷烟主流烟气、颗粒相与气相造成的微核效应是不同的，这表明，烟气的各个部分都会对细胞微核效应产生影响。此外，他们使用光度计光散射技术作为一种实时测量工具进行半定量和监测烟气输送，以确保试验数据的稳定性和可重复性。

和其他暴露系统一样，VC 10系统有它自身的局限性。目前，有关VC 10系统的使用或介绍其性能的科学出版物比较少。此外，VC 10系统有很多参数可以设置，从而创建出所需的暴露模式。例如，稀释空气流（L/min） 和样品流量（mL/min/板） 都可以独立调节。然而，这种灵活性有可能是VC 10系统没有得到大规模使用的原因，因为这些参数的设置操作还没有充分完善。然而，这种情形在发生着变化，最近的一项研究使用这些参数来分析暴露模块中的颗粒沉积量。有意思的是，增加样品流量（mL/min）会使曝光模块内产生的颗粒沉积量减小。

2.5 CULTEX系统

位于德国汉诺威的CULTEX实验室为空气中的物质的体外毒理学分析，如油气、颗粒物、挥发性化合物和复杂气体混合物，提供了空气-液体界面（ALI） 暴露试验的解决方案。CULTEX公司设计的体外暴露模块可以应用于各种暴露系统，适用于多种暴露条件。因此，CULTEX系统在研究体外气溶胶暴露和吸入毒理学中发挥了积极作用。

在过去的10年中，CULTEX暴露模块被用于研究许多复杂的气溶胶，如柴油机车废气、卷烟烟气、药理学研究、挥发性化合物、颗粒物和环境污染物。这些研究的多样性表明了CULTEX暴露模块的应用潜力。

在1999年和2000年，Aufderheide及其同事率先介绍了CULTEX暴露模块的概念，在最初的2篇文献中，概述了如何使用CULTEX系统对可吸入化合物（颗粒、矿物纤维和木屑）进行体外ALI暴露试验。2001年，Ritter等人用CULTEX系统对合成的臭氧、二氧化氮进行了测试，以探索CULTEX暴露模块内部的暴露条件，说明该模块可以为环境毒理学（空气中的化学物质）试验提供多种研究方法。此外，Aufderheide等人对CULTEX模块的性能做了进一步摸索，烟气暴露之后，他们利用荧光分光光度计技术，检测了颗粒沉积量、细胞活力和细胞谷胱甘肽表达水平。

CULTEX系统的最新进展是径向流系统（RFS），可对培养基进出量进行精确控制。径向排列的细胞培养孔均匀分布在中央进气口周围，使烟气输送更加均匀。RFS使用了“喇叭型”设计，使气溶胶几乎能直接输送到细胞层。2011年，Aufderheide等人利用RFS系统，研究了人支气管上皮细胞16HBE暴露于香烟烟气后的细胞毒理学反应。此外，还利用RFS系统，以沙门氏菌株TA98和TA100为受试菌株进行Ames试验，分析了暴露于卷烟烟气后产生的回复突变菌落。Aufderheide等人最近的一个研究表明，RFS模块中3个细胞培养孔流过的烟气量是一致的，其中的一部分数据由计算流体动力学方法获得，这个方法可以使研究人员更深入地了解暴露模块中的烟气流量情况。RFS模块的培养孔呈径向排列，这从根本上不同于呈线性对称排列的其他暴露模块，从而消除了线性采样所造成的浓度差异。除了不同细胞培养孔烟气流量一致，RFS模块也可以同时培养3种不同的细胞，也可以进行Ames试验。有意思的是，Aufderheide还分析了雾化纳米氧化铜（CuO）颗粒的大小、分布与其沉积量之间的关系。例如，与细微颗粒相比，A549细胞直接暴露于纳米氧化铜时，细胞毒性增加了。

对于多种暴露情况和气溶胶化合物，CULTEX实验室提供了多种暴露模块。CULTEX实验室还提供了沙尘气溶胶发生系统，它由3个独立的部件构成：一个液压机用于将各种粉末颗粒压成粉饼，一个粉尘发生器用来提供均匀浓度的气雾灰尘，一个综合淘洗器用来贮存沙尘气溶胶，这个综合淘洗器像一个水库一样贮存着产生的颗粒物质。