乳及乳制品中抗生素检测方法研究进展

刘 硕，王胜洁，贾丽娜

（河北农业大学理工学院，河北沧州 061100）

牛奶营养丰富，可提高人体免疫力、增强体质，是对人类最有益、最健康的食品之一。随着高速发展的乳及乳制品行业，其中广泛应用了β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类等抗生素，虽然让畜牧业达到了增产的效果，但也不可避免地造成了抗生素的残留[1]。因此，为解决我国当前乳和乳制品行业面临的难题而寻求简便快捷、敏感性高的抗生素检测方法已成为当务之急。

1 乳制品中抗生素残留现状

自2001年10月我国农业部发布的《无公害食品生鲜牛乳行业标准》中明确提出新鲜牛乳“抗生素不得检出”的卫生指标。但对这一标准，我国并没有严格执行，所以一直未能解决我国奶制品中抗生素残留问题，致使人们开始担忧牛奶的安全问题，并成为越来越受关注的热点[2]。

2009年，刘维华等人[3]对宁夏的363批生乳进行检测，检测出β-内酰胺酶112批，总抗生素残留145批，发现有非法添加、违反休药期规定的抗生素超标现象。2012年，张萍等人[4]对镇江地区市售包装纯牛奶及奶牛养殖场的生鲜牛奶进行随机抽样检测，发现都有一定量的抗生素残留。由此看来，我国乳业中还会长期存在牛奶中抗生素残留的现象。

2 乳制品中抗生素来源

抗生素被广泛地应用到奶牛养殖产业中，在对奶牛进行疾病治疗和饲喂过程中很容易造成抗生素残留，更因为一些人为因素，使抗生素直接残留在牛奶中。乳制品中抗生素残留的原因有：①抗生素常被当作治疗药物而用来预防和治疗奶牛的各类疾病，经注射或者饲喂进入体内，通过血液进入乳房而残留于牛奶中，尤其是治疗牛乳腺炎时使用的灌注法，极易造成残留；②为达到预防疾病并提高产量的目的，在奶牛饲料中加入抗生素，奶牛食用消化，可能进入各个组织器官，造成抗生素残留；③不法商户在挤奶、储存运输过程中的不规范操作，在高温季节向牛奶中掺杂各种抗生素，以防止牛奶酸败变质和细菌的生长繁殖，直接造成抗生素残留。

3 乳制品中抗生素残留危害

抗生素残留于牛奶中会降低牛奶品质，还会给饮用的人们带来身体上的危害，长期饮用则非常不利于人体健康，甚至会残留在环境中污染环境。乳制品中抗生素残留的危害有：①长期饮用含抗生素残留的牛奶可使人体内某些致病菌产生耐药性，造成菌群失调，患病后再使用同种药物会降低治疗效果，自然而然使人的免疫力下降；②在经常食用低剂量抗生素残留食品的情况下，易感人群会出现超敏反应，短时间内出现喉头水肿、呼吸困难、血压下降等症状，严重者甚至休克[5]；③对体内敏感菌起到一定的抑制作用，但会导致体内细菌不敏感，在体内扩散，造成双重感染，破坏肠道菌群平衡，从而破坏人体微生态平衡；④抗生素残留的牛奶被人或动物食用后，未吸收的抗生素会从尿液和粪便中排出，留在环境中污染环境。

4 乳制品中抗生素残留检测方法

近年来，检测技术发展迅猛，已经有大量简便快捷且成本低、灵敏度高的检测方法应用到乳制品抗生素残留检测中，如微生物检测、理化检测、免疫检测等。未来更需要人们不断探索研究出更加精确、简便的检测方法来满足日趋严格的检测要求。

4.1 微生物检测法

微生物检测法是经典的较为广泛应用的方法，测定原理是根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来定性确定样品中抗微生物药物残留[6]。它的测定时间长、结果误差大、操作简单、成本低，不需要大型仪器和专业操作人员完成，可在一般实验室和农场使用。微生物检测主要包括TTC法、试剂盒法等。

TTC法[氯化三苯基四氮唑（Tripheye tetrazolium chloride）]是我国鲜乳中抗生素残留检测的标准方法（GB 4789.27—2008） 第一法。其原理是利用 2,3,5氯化三苯四氮唑与指示菌反应显色，当物质中有抗生素残留显色，无残留则不显色。然而，此法的检测灵敏度还不够高，而且时间较长，在3 h以上，但很适合奶牛场和食品卫生检测部门使用。

黄怡君等人[7]采用TTC法对奶牛场常用的青霉素、红霉素、卡那霉素、环丙沙星和磺胺嘧啶等几种抗菌药物检测其最低检测浓度，其结果为青霉素3 μg/kg，红霉素 30 μg/kg，卡那霉素 6 200 μg/kg，环丙沙星500 μg/kg，磺胺嘧啶100 μg/kg。TTC 法应用范围较广，符合我国奶牛场中较多种类抗生素的使用现状。

试剂盒法为牛奶中抗生素残留的检测提供了一种更方便、更有效的方法。其原理为：在65℃加热微孔板，孢子萌发产酸，使培养基的pH值下降，颜色由紫色变为草绿色或黄色。如果牛奶中含有比检测限高的抗生素，就抑制了孢子萌发，不产生酸，培养基保持原来的颜色。此方法用肉眼观察颜色变化即可判断抗生素残留情况[8]。

谢莉等人[9]以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌，溴甲酚紫为指示剂，加入合适的营养基质作为辅助，研制了96孔板试剂盒法。对牛奶中青霉素、阿莫西林以及头孢匹林的检测限进行试验，测出其检测限分别为3，4，8 ng/mL。刘冬梅等人[10]也利用嗜热脂肪芽孢杆菌对β-内酰胺类抗生素敏感的特点，优化其生长条件，制成试剂盒，测出青霉素钠的检测限为2～4 μg/L。试验证明，此法灵敏度高于国标TTC法，而且省去了TTC法复杂的前处理，便宜快捷，适于推广应用。

4.2 理化检验法

理化检测方法是以抗生素分子性质为基础，借助试验仪器进行分离和检测的一种方法。分离检测应用的试验技术包含色谱和电泳、紫外、荧光、质谱等。因为检测灵敏、结果精确稳定，理化检测法是一种精确检测抗生素残留的方法[11]。

王浩等人[12]采用液相色谱-串联质谱方法对我国市售的50种乳品进行了检测，检出其中样品氯霉素含量为0.48 μg/kg。这些样品的检测限不合格，违反了我国食品可食用组织不得检出氯霉素的相关规定。张尹等人[13]结合超声辅助萃取和固相柱萃取，优化了HPLC色谱分析条件，建立了完整的HPLC检测牛奶中β-内酰胺抗生素残留的分析方法。

这些方法具备定性和定量准确度较高等优点，但检测仪器的费用较高、程序较复杂、有机溶剂的使用量很大，对人体和环境具有一定的危险性。

4.3 免疫分析法

酶联免疫吸附法（ELISA）的特点有灵敏度高、特异性强、处理量大等优点。目前，应用最为广泛，认可最高的是美国SNAP利用酶联免疫和激光探测技术研发的SNAPTM抗生素残留快速检测系统，可以快速检测出牛奶中的抗生素残留量，但其影响因素较多，是国内外抗生素残留比较普遍、快速的检测方法[14]。

ELISA试剂主要对β-内酰胺类抗生素较敏感，对其他抗生素药物的敏感度不高，何金环等人[15]用ELISA法对随机抽取的50份纯牛奶样品进行抗生素残留检测，测出其抗生素阳性率为20%。姜侃等人[16]建立直接ELISA竞争法，检测已知阴性和阳性的生鲜牛乳中的β-内酰胺类抗生素，优化了检测条件，试验结果准确，并未出现假阳性或者假阴性结果。ELISA测定法适于大量样品检测，可以推广。

4.4 新检测技术研究进展

免疫分析法具有影响因素多的缺点，理化检测技术具有检测程序复杂、检测费用高等缺点，为克服上述缺点，将二者结合已经成为当今发展的一个趋势。

表面等离子体共振（SPR）生物传感器利用了免疫学的测定原理，可以进行多个样品的快速检测。刘瑾等人[17]在竞争法检测的基础上采用基于表面等离子体共振信号放大传感器，对链霉素、卡那霉素的水溶液进行了残留检测试验，最低检测限分别由34 ng/mL和25 ng/mL降为24 ng/mL和12 ng/mL。结果表明，SPR生物传感器在检测牛奶抗生素残留方面具有良好的应用前景。

蛋白质芯片（Protein chip）技术是将已知的蛋白分子产物固定在经特殊化学处理的固相载体上，根据生物分子特性，捕捉能与之特异性结合的待测蛋白，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析。金娜等人以免疫竞争为原理，优化各项影响因素，快速、准确的检测出呋喃唑酮代谢物（AOZ）的检测限达到0.1 ng/mL。经试验证明，蛋白质芯片技术可以有效进行抗生素检测分析，适于推广应用。

5 结语

从近15年来的检测方法在牛奶抗生素残留检测中的研究进展及应用状况来看，微生物检测法不需要大型仪器和专业操作人员，简便、快捷，适用于一般的乳制品厂、奶牛牧场、防疫站使用。免疫分析法虽然取样量小，前处理简单、处理量大，但其影响因素较多，使大部分技术仍然停留在实验室水平。近年来，随着试验仪器的微型化、便捷化，将生物传感器与蛋白芯片技术相结合，逐步应用到牛奶抗生素残留的检测中，或将是未来发展的必然趋势。

参考文献：

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[3]刘维华，刘学琴，付少刚.宁夏生乳质量安全现状及对策 [J].中国乳业，2011（1）：66-67.

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[12]王浩，赵丽，杨红梅，等.液相色谱-串联质谱法测定牛奶中35种四环素类、磺胺类、青霉素类、大环内酯类、氯霉素类抗生素残留 [J].色谱，2015，33（9）：995-1 001.

[13]张尹，毕莉，徐兴志，等.超声辅助萃取-高效液相色谱法测定牛奶中9种β-内酰胺抗生素残留 [J].云南大学学报（自然科学版），2011，33（3）：332-335.

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[16]姜侃，陈宇鹏，金燕飞，等.应用酶联免疫法快速检测乳品中β-内酰胺类抗生素残留 [J].中国乳品工业，2010，38（1）：51-54.

[17]刘瑾，王文，张婉洁，等.基于表面等离子体共振传感器信号放大的抗生素残留检测 [J].分析试验室，2012，31 （11）：5-9.◇