烟用添加剂生物学评价技术进展

李 源，韩亚伟，张东鹏，黄丽苹，李欣欣

1 烟草制品添加剂概况

作为烟草工业的一种添加剂，烟用香精香料对于卷烟增香提味来说具有重要作用，是生产卷烟不可或缺的原料，香精配方属于卷烟加工企业的核心机密之一，香精香料和其他添加剂的使用同一个卷烟品牌的创立与发展壮大息息相关。烟用香精香料是专门为卷烟加工企业生产的原料，一般不能用于其他非烟草企业[1]。

1.1 烟用香精香料分类

依据香料来源，通常将其分为天然的和合成的两大类，目前己被发现的天然香料有4 000多种，合成香料更是多达8 000余种，合成香料中有一个种类称为天然等同香料，指虽然在自然界中存在并己经被发现，但是由于自然界中的产量有限，主要采用人工合成的方法以供大量使用，目前烟草加工工业使用的多为此类物质。

1.2 烟用香精香料的作用

依据对卷烟制品的吸食品质贡献，通常可将烟用香精香料分为不同系列，不同系列具有不同的作用。烟用香精香料的作用集中体现在降低烟气危害组分和提高卷烟吸食品质这2个方面，合理添加烟用香精香料对卷烟制品的品质标准不可或缺，是形成卷烟风味和风格的重要因素[2]。

1.3 吸烟与健康

卷烟烟气化学试验数据指出，卷烟烟气气溶胶中已经得到确认的化学成分多达5 000余种。其中，60余种可以认定为致癌物，还有一些促癌物和辅助致癌物。1997年，Hoffhlann提出了所谓的Hofifllann名单，总结出了烟气混合物中的一部分代表性危害组分，包含13类化学物质，共计44种[3]。

1972年研究显示，低焦油烟卷对人体身心健康的影响程度相对较小。此后，众多国家与地区推行了控制焦油和尼古丁含量的严格法律，如欧盟法律允许的单支最高焦油含量从1993年的15 mg到1998年12 mg，再到2004年的10 mg。再看我国，2002年底的时候，我国单支卷烟的焦油含量加权平均值为14.7 mg，2010年底时降到了11.5 mg；截至2017年5月，降到了10.3 mg， 含量8 mg以下低焦油卷烟全国销量达到了创历史的366.14万箱，同比增长8.20%，并且含量6 mg以下的低焦油卷烟全国销量达到了前所未有的58.10万箱，同比增长10.94%[4]。

2 烟用添加剂生物学评价方法

安全性评价，就是从毒理学的角度，研究外源性物质对机体的毒理作用机理，检测和评价该物质对机体的安全性和安全范围，从而保持机体的健康。

目前，最常用的烟草制品安全性评价方法是对焦油量、烟气一氧化碳量和烟气烟碱量这三大指标的含量进行分析评测，这三大指标也是每年国家烟草专卖局用来衡量各个烟草工业企业烟草制品质量的重要参考依据，涉及烟用添加剂的生物学评价方法则比较少，这显然是不全面的，烟气一般都具有细胞毒性和遗传毒性。

2.1 国外近年来生物学评价技术进展

半个世纪以来，国际四大烟草工业集团对卷烟和烟用香精香料的生物学评价方法进行了大量基础性研究工作。从上世纪90年代初开始，雷诺烟草公司以Eclipse卷烟为试验样品，关于卷烟生物学评价的研究主要分为2个方面：①毒理学试验。如体外毒理学试验测定细胞毒性和遗传毒性、核酸加合物分析、小白鼠皮肤外致瘤涂布试验，以及小白鼠呼吸道系统（鼻子、喉咙、肺叶）的病理解剖分析。②吸烟试验。检测分析志愿者的呼吸曲线，血液、尿液中的羟基血色素和尼古丁含量变化，观察记录肺部发炎症状。

英美烟草公司的生物学分析检测方法为染色体畸变分析、中性红细胞毒性分析、体外烟气短期细胞毒性分析、细菌基因突变与回变——Ames分析、烟气混合物中Hofifllann产物定量与分析和微核彗星试验。

菲利普·莫里斯烟草公司的生物学检测分析方法为周围环境卷烟烟气释放量测定与分析、90 d亚慢性毒性分析、体外遗传毒性及细胞毒性测定、临床试验和烟气混合物代表性危害成分定量测定与分析等。

2004年10月10日—10月12日，卷烟产品及烟用香精香料生物学评价技术与低焦油烟草制品研发国际学术报告会在杭州举行。会上，有关烟用香精香料生物学评价方面的论文有3篇，分别是考旺斯公司Clements博士的《体外毒理学评价烟用香精香料的实验设计》[5]、英美烟草公司Messey博士的《烟用香精香料对于卷烟烟气化学及细胞毒性的影响》和菲利普·莫里斯烟草公司德国汉堡研究实验室Rmer博士的《体内测定分析烟用香精香料的生物学活性》。

2002年，国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）成立了烟用香精香料体外生物学评价工作组，依据国际公认的体外生物学试验测定程序并加以优化。通过广泛的文献阅读分析和近4年的研究工作，工作组建立了3种评价烟草制品毒理学指标的试验方法：①推荐使用鼠伤寒沙门氏菌突变试验进行细菌诱变试验；②推荐使用小鼠淋巴瘤细胞试验或染色体畸变试验或彗星试验进行哺乳动物细胞遗传毒性分析；③推荐使用中性红细胞法检测细胞毒性。

从国际上正在开展的烟气化学生物学评价方法研究工作来看，3项生物学活性测定指标：①细菌诱变能力；②染色体致畸变能力；③细胞毒性大小已经得到了普遍应用。

2.2 国内近年来生物学评价技术进展

近年来，国内一些科研院校与卷烟工业企业充分合作，初步开展了一些有关安全性研究的生物学试验。中国预防医学科学院医学研究与检测中心（上海）已经公开发布了低焦油低危害卷烟制品（PREP）的某些试验结果，主要有烟气组分中巴豆醛和芳香胺含量分析，以及彗星试验、Ames试验、急性亚急性细胞毒性试验、中性红细胞试验、总过氧化物酶检测和小鼠3个月吸烟亚慢性体内毒性试验。

云南中烟下属的云南烟草科学研究院基于自身之前在毒理学领域的研究工作，组建了毒理学实验室，这是烟草科研机构中的第1个，逐步探索出一系列灵敏、快速且适用于卷烟烟气组分生物学安全性评价的试验方法，确定了几个烟气毒理学评价的安全性指标，从宏观和微观2个层次上分别评价卷烟烟气的安全性。建立了5种试验方法用于研究卷烟烟气混合物的3个重要毒理学活性指标——卷烟烟气急性毒性、细胞毒性和遗传毒性。系统地将细胞生物学技术应用于卷烟安全性评价中，这在国内是首次。建立了一系列卷烟烟气生物学评价方法，该体系可进行10项指标的分析测定。由其自行设计并制造成功的小白鼠被动吸烟装置，已获得国家发明专利，可用于进行烟气混合物对被动吸烟小鼠所造成的急性亚急性生物学试验。

郑州烟草研究院结合自身特长，充分利用资源，先后建立了一系列卷烟安全性评价体系。建立了卷烟主流烟气冷凝物的Ames试验方法，挑选对烟气混合物敏感的TA98和TA100作为受试体，使用5%S9混合液作为活化系统，这样一来，不仅使某些化合物的灵敏度得到了提高，试验结果也变得更加可靠，新方法更加适用于复杂的卷烟烟气混合物组分致回突变性的分析[6]。

来自中国军事医学科学院放射医学研究所的朱茂祥高级工程师完成了大量的生物学评价技术研究，建立了一系列烟草制品生物学评价体系，主要有关于卷烟烟气混合物中代表性危害成分和一些添加剂等的细胞活性检测。朱茂祥研究员承担的专项课题——卷烟烟气安全性生物学评价技术，利用现代毒理学的原理和方法作为主要试验手段，把卷烟烟气混合物中的全部化学物质用剑桥滤片收集起来作为整体受试物，研制了卷烟烟气动物染毒装置和卷烟体外毒理学主流烟气暴露装置，评价卷烟烟气的急性和长期毒性、致突变能力、致畸畸变能力和致癌作用，以及其他毒理学试验[7]。

2.3 实验室烟草毒理学试验技术进展

实验室成立于2010年3月，以学院食品安全研究工作为基础，结合烟草制品安全性评价的需要，整合资源，随省局共建烟草工业生物技术重点实验室的成立而逐步发展和完善，建有装备齐全的细胞培养室，主要利用分子生物学和细胞生物学实验技术开展研究，预期建立体内体外相结合的毒理学评价技术体系。目前已完成的试验成果主要有：4种烟草重金属离子通道蛋白转录组的分析及应用研究，建立了小白鼠活体毒理学评价模型，建立了全烟气及烟草特有亚硝胺动物毒理模型[8]，建立了全烟气致小鼠肺损伤模型[9]，研究了NNK对V79和NCTC 1469 2种细胞增殖和凋亡的影响。

3 烟用添加剂安全性评价技术前景与展望

目前，香精香料的使用与否主要看其燃吸时对香气质和香气量的贡献，较少考虑其毒理学评价，对于烟用添加剂的安全性标准，世界范围内也还没有统一的准则与规定。但是，烟用香精香料在烟草制品中的应用相当广泛，而且烟用添加剂种类繁杂，含量指标不具备可视性，加入烟草制品后对产品的稳定性和质量影响不好预测。因此，进行香精香料的毒理学研究试验对于合理使用烟用香精香料具有深远意义。在吸烟与健康这两者矛盾之间找到适当的平衡点不仅仅是烟草毒理学研究的重大目标，对于烟草工业的长远发展也关系密切。

随着我国经济市场对外开放程度的增加，外国烟草公司必将更加广泛地参与到烟草行业中来，民族卷烟工业面临的竞争将更趋激烈。进行烟草毒理学研究，明确烟气危害成分和毒理机理，开发新型低危害高香气卷烟制品，提高中式卷烟品牌价值，进而在激烈的国际竞争中独占鳌头。

[1]吴维佳.烟用香精香料对卷烟安全性的影响 [D].长沙：湖南农业大学，2010.

[2]吴维佳.烟用香精香料的细胞毒性研究 [J].湖南农业科学，2010（9）：91-93，98.

[3]Hoffmann D，Djordjevic M V，Rivenson A，et al.Relative potencies of tobacco-specific N-nitrosamines as inducers of lung tumours in A/J mice[J].Cancer letters，1993 （1）：25-30.

[4]朱茂祥.中式低危害卷烟的毒理学评价技术 [G]//中式卷烟理论内涵讨论论文汇编.北京：国家烟草专卖局科技教育司，2004.

[5]Clements J.Study design consideration for in vitro toxicity assays on ingredients[G]//烟草制品及卷烟添加剂安全评价与低潜在性危害卷烟产品开发国际研讨会会刊.杭州：国家烟草专卖局，2004.

[6]聂聪.卷烟安全性评价体系的建立（2） [J].中国烟草学报，2011（4）：102，

[7]王永超，贾梦珠，程生博，等.烟草石油醚含量研究[J].农产品加工，2017（6）：51-52，55.

[8]宁维.全烟气及烟草特有亚硝胺在小鼠中的安全性研究 [D].郑州：河南农业大学，2014.

[9]宁维，陈利平，李瑜，等.全烟气致小鼠肺损伤模型的建立 [J].烟草科技，2013（11）：36-40.◇