顺铂耳毒性机制及抗氧化药物局部应用的预防作用

於得红 汪雪玲 陈聿名 吴皓

上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科上海交通大学医学院耳科学研究所上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

顺铂作为一种广谱抗癌药，对泌尿生殖系统肿瘤、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、软组织肉瘤等均具有一定的治疗效果。另外，顺铂对肿瘤的放疗也有较好地增敏作用。顺铂肾毒性可通过利尿剂得到有效缓解。然而，剂量依赖性的顺铂耳毒性依然限制其更好地发挥疗效甚至导致停药。至今仍无FDA批准有效预防或治疗顺铂耳毒性的药物上市。尽管顺铂耳毒性无生命危险，但是其逐年升高的发生率仍然引起医学科学研究者的广泛关注。目前，约40-80%接受顺铂治疗的成年肿瘤患者和22-74%儿童肿瘤患者出现永久性听力损伤[1,2]。顺铂耳毒性严重降低了患者的生活质量，尤其影响儿童早期语言发育和社会认知能力。因此，阐明顺铂耳毒性作用机制，有助于探索其预防和治疗策略，具有重大临床意义。

在过去的20多年间，多种制剂和药物被开发用于预防或治疗顺铂耳毒性。其中，研究热点聚焦于抗氧化物对顺铂耳毒性的预防和治疗作用及机制的研究。顺铂通过激活线粒体途径诱导听觉细胞凋亡，因此，通过靶向线粒体途径可有效抑制该途径依赖的细胞凋亡。此外，以促炎症反应因子为靶点制剂也具有耳毒性预防作用。最新研究聚焦于阐明顺铂如何进入耳蜗内听觉毛细胞和其它细胞，进而研发可特异性抑制顺铂进入上述细胞途径而不影响顺铂抗肿瘤疗效的新型药物。本文详细阐述目前公认的顺铂导致耳蜗听觉毛细胞和其他相关细胞的损伤或死亡等耳毒性作用机制，同时对当前具有顺铂耳毒性保护作用的代表性的抗氧化药物的基础和临床研究进行总结，为未来顺铂耳毒性药物研究开发提供理论依据和方向性指导。

1 耳蜗自身抗氧化活性防御体系

耳蜗正常功能的维护需要血管纹、螺旋韧带和螺旋突起区域具备活跃的新陈代谢活性以促使线粒体呼吸链释放电子，使氧气（O2）转变成超氧化物（O2-）。噪音、老龄化、使用抗生素和顺铂等耳毒性药物等环境因素均会刺激耳蜗新陈代谢加速，进而造成氧化应激反应。大量实验证实，顺铂耳毒性药物或通过激活促活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生的酶活性或通过抑制抗氧化物产生的酶活性提高耳蜗内活性氧的产生[3]。注射顺铂的大鼠耳蜗内谷胱甘肽（GSH）活性和抗氧化物酶活性降低。有研究报道，经鼓室给药NOX3小干扰RNA有效保护顺铂引起耳毒性[4]，提示顺铂导致ROS产生升高的主要作用靶点是NOX3 NADPH氧化酶系统。

耳蜗具备天然的抗氧化防御体系，包括维生素C，维生素E和含有小分量硫醇的GSH。研究发现，GSH主要表达于血管纹底部和中部，以及螺旋韧带细胞内，该分布与外源性物质结合和解毒的GSH S-转移酶分布一致[5]。另外，耳蜗表达超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶(GSH.Px)和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化物酶。SOD催化O2-变成H2O2和H2O，而CAT又可催化H2O2变成O2和H2O。GSH.Px减少H2O2和其他可能的氧化物的形成，同时通过催化还原性GSH转化成氧化性GSH（GSSG）并清除H2O2。另外，谷胱甘肽还原酶（GR）帮助GSH从氧化型转变成还原型，在耳蜗抗氧活防御体系中发挥重要作用。SOD的两种亚型表达在耳蜗内。Cu/Zn-SOD定位于细胞胞质中，而Mn-SOD定位在线粒体内[6]。Mn-SOD分布在耳蜗内血管纹，螺旋韧带，螺旋突，螺旋缘和Corti氏器等代谢活性位点[6]。在没有这些ROS解毒作用的自身防御系统，ROS会通过产生脂质类过氧化物，丙二醛等对细胞造成损伤。

2 顺铂耳毒性分子作用机制

最新研究发现，顺铂经静脉注射后，在大多数器官中数天或数周内即被清除，然而在耳蜗组织中却会持续滞留数月甚至数年[7]。顺铂导致耳毒性的细胞水平和分子水平作用机制尚未完全阐明。目前，普遍公认的顺铂细胞耳毒性作用机制主要包括三大方面：

1）顺铂通过哺乳动物铜离子转运蛋白（CTR1）、有机阳离子转运体（OTC1-3）或机械转换器通路（mechanotransducer，MET）介导进入耳蜗细胞胞质形成水性复合物，引起DNA损伤和交叉结合，导致分子传感器共济失调基因突变（ATM），诱发抑癌基因p53激活，进而提高Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达，促使线粒体中细胞色素C释放，最终导致capase 3激活的凋亡。鼓室内注射CTR1底物硫酸铜可有效保护顺铂引起的听力损失[8]。OCT抑制剂甲氰咪胍的使用有效降低顺铂引起的肾毒性和耳毒性[9]。近期研究发现，顺铂依赖MET通路导致斑马鱼毛细胞损伤[10]。TRP（Transient receptor potentical）通路分子TRPV4，TRPA1，TRPC3，TRPML3也在耳蜗内表达，介导氨基糖苷类抗生素进入肾脏细胞[11]。然而，这些信号通路分子是否介导氨基糖苷类抗生素和顺铂进入耳蜗毛细胞，尚未见相关报道。

2）顺铂引起内耳ROS累积诱发细胞毒性。顺铂通过激活NADPH氧化酶，降低抗氧化物酶（SOD，GR，GST和GSH-Px）。ROS升高导致细胞色素从线粒体中释放，导致细胞凋亡。普遍认为耳蜗细胞抗氧化能力降低来自以下四个方面[12]：1）顺铂与抗氧化酶的巯基基团共价结合，从而使酶失活；2）SOD和GSH.Px活化必需的铜、锡等金属辅助因子丢失；3）ROS的升高需要消耗更多的抗氧化物酶；4）耳蜗内抗氧化物酶GSH.Px和GR活化必需的辅助因子过度消耗，如GSH，NADPH等。

3）顺铂促进细胞炎症因子释放，包括TNF-α,IL-β，IL-6和NF-kB释放入细胞质。促炎症因子和ROS产生相关联，同时抑制IkB降解以保持NF-kB在胞质中处于失活状态[13]。NF-kB一旦激活会被转运至细胞核引发一系列细胞活动，包括促炎症因子的从头合成，促凋亡因子caspase-3和9活化，提高诱导型一氧化氮合酶活化[14]。

3 具备顺铂耳毒性预防效果的代表性抗氧化药物

当耳蜗内有大量ROS激活时，自身抗氧化防御体系将无法完成活性氧清除，需要外源性抗氧化剂缓解氧化应激反应。其中，具有代表性的抗氧化药物如下：

1）硫代硫酸钠（Sodium Thiosulfate，STS）

研究证实，STS可借助其巯基基团与顺铂形成复合物使顺铂失活；或直接终止ROS活性；或保持抗氧化物酶活性等方法拮抗顺铂耳毒性[16]。STS是目前通过巯基基团拮抗顺铂耳毒性效果最佳的抗氧化物。然而，外周血液中硫代硫酸钠极大拮抗顺铂抗肿瘤疗效。研究证实，硫代硫酸钠显著降低人血液中游离顺铂的浓度。给予硫代硫酸钠10 min后，血液中仅有31%顺铂，50 min后，血液中检测不到顺铂；而未给予STS组，10 min后血液中可检测到高达87%的顺铂，顺铂可持续检测长于3 h[16]。

为规避STS在外周血中的肿瘤抗药性，改用鼓室内用药，然而动物实验中并未取得有效的听力保护结果[17]。采用手术创伤较大的导管植入方式在耳蜗内给予一定量的STS，与对照组相比，STS组在实验频率下（2-30 kHz）下均有显著的听力保护效果，频率越高，保护效果越好[18]。最新研究发现，高粘度透明质酸包载STS粘附于圆窗膜，可保持骨阶淋巴液中高浓度STS，而血液中STS浓度较低，进而实现在保护顺铂引起毛细胞损伤同时降低对顺铂抗肿瘤疗效的影响[19]。药物递送系统和渗透泵等的改良优化将有助于提高STS鼓室内给药的效率，最终实现STS顺铂耳毒性保护效果最大化，同时对顺铂抗肿瘤疗效的影响最小化的目的。

2017年报道的随机III期临床试验（NCT00716976）证实STS在给予顺铂儿童肿瘤患者中体现较好的保护听力作用，且未引起不良反应[20]。肿瘤患者给予顺铂6 h后给予STS组，最后一次给予顺铂4周后测听力。结果表明顺铂加STS组仅有28.6%的患者出现听力下降，而单纯顺铂组高达56.4%的患者出现了听力下降[20]。然而，该研究同时发现，顺铂加STS组肿瘤转移患者，三年生存率仅有45%，严重低于顺铂组的84%。相比而言，对于原发肿瘤，顺铂加STS组的生存率与顺铂组无差别。另一个以原发肿瘤患者给予顺铂治疗患者为对象的多中心、随机、非盲、III期临床试验研究（NCT00652132）已于2017年底完成[21]。STS临床阶段研究取得一定的进展，但仍需在STS给药策略（给药频次、剂量）等方面进行进一步研究。

2）N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl Cysteine,NAC）

NAC通过多种途径抑制顺铂引起的耳毒性，具备双重抗氧化活性，包括直接与顺铂形成复合物或与胞质内顺铂水解复合物结合使其失活[22]。同时，NAC通过抑制JNK,p38 MAPK和NF-kB转录因子激活提高细胞存活，激活ERK途径抑制细胞凋亡[23]。NAC系统性用药存在与STS相同的问题，即拮抗顺铂的抗肿瘤疗效。因此，NAC系统性用后后对顺铂耳毒性保护作用的研究报道结果各不相同。例如，鼓室内注射2%NAC在动物实验中证实顺铂耳毒性保护作用良好，然而在在临床研究中却无任何效果[24]。与此相反，2013年的临床试验证实鼓室内给予10%NAC可有效保护顺铂引起的听力下降，在8kHz有显著性差异[25]。浓度提高至20%，患者出现内耳炎症和无法承受的疼痛[25]。尽管鼓室内给予较高浓度药物，然而耳蜗内淋巴液中药物浓度并未达到理想治疗浓度，大部分药物经咽鼓管流失代谢。此外，鼓室内短时间内连续多次给药也增加了患者的痛苦。上述临床试验中2周内间隔给药共8次，引起无数患者抱怨[25]。Ciftci等[26]借助水凝胶载体系统经鼓室输送NAC，初步实验结果证实，该系统具备可控缓释特性，且材料降解无需体外水分，凝结成胶体时间较普通胶体迅速。然而，在顺铂耳毒性保护动物模型上的实验有待进一步研究。

确定NAC对顺铂耳毒性保护作用的给药剂量以及联合顺铂给药方案优化的I期临床试验（NCT02094625）正在进行中[27]。根据这项研究，年龄在1-21岁的30名肿瘤患者接受顺铂4h后，静脉注射NAC 30min，持续3个用药周期。试验已于2018年2月完成。

3）D-甲硫氨酸（D-Methionine）

D-甲硫氨酸是L-甲硫氨酸的异构体，已被证实具有顺铂耳毒性保护作用。D-甲硫酸钠通过直接与顺铂形成复合物使其失活、保护内源性抗氧化物酶活性发挥顺铂耳毒性保护作用。Campbell等[28]报道顺铂促进了脂质过氧化反应的分子标志物丙二醛形成，显著抑制SOD，CAT，GR和GSH-Px活性。顺铂用药前30 min给予D-甲硫氨酸有效保存GR，SOD和CAT活性，同时导致丙二醛显著降低。然而，并未观察到对GSH-Px活性保护作用[28]。当系统性多次给药后，D-甲硫氨酸在动物实验中表现出听力保护作用[28]。

与含巯基基团的其他抗氧化剂相似，D-甲硫氨酸经系统性用药后也存在拮抗顺铂抗肿瘤疗效的难题。Ekborn等[29]详尽研究了D-甲硫氨酸和顺铂合用时药物代谢动力学的改变，与顺铂单独用药相比，联合用药将顺铂药物浓度-时间曲线下面积（AUC）降低了近30%，这也是D-甲硫氨酸拮抗顺铂抗肿瘤疗效的主要原因。D-甲硫氨酸对顺铂抗肿瘤疗效的拮抗作用强度因肿瘤类型、动物模型、给药频次以及两药剂量比例不同而呈现不同的效果。因此，关于顺铂与D-甲硫氨酸之间药物相互作用的机制的相关研究有待进一步进行。D-甲硫氨酸分子量比较小，适合局部鼓室内给药。已有研究证实，D-甲硫氨酸经圆窗膜给药后体现出动物水平上的顺铂耳毒性保护作用，但其对顺铂抗肿瘤疗效是否有抵抗作用并不明确[30]。

一项II期临床试验（MRX-1024）研究发现，口服的D-甲硫氨酸的放疗和化疗联合使用的患者，10kHz下有较好的听力保护作用。然而，在没有放疗情况下，不明确D-甲硫氨酸的安全性和有效性[31]。同时，未见其他有类似保护作用的研究报道发表。

4 结语

具有顺铂耳毒性保护作用的抗氧化物临床试验研究正在逐步开展，其研究结果往往存在很大争议。临床试验研究受各种因素制约，包括给药方案制定、联合使用方案、给药途径、听力检测时间及方法、耳毒性级别评价、队列人数多少、患者年龄、肿瘤类型以及肿瘤是否发生转移等。抗氧化物顺铂耳毒性保护作用的临床应用有待于临床试验研究的进一步完善。同时，随着顺铂耳毒性作用机制机制研究的不断深入，新的分子机制将为其预防治疗提供新的作用靶点。最新研究发现，细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）抑制剂kenpaullone鼓室给药后有效降低成年小鼠顺铂耳毒性[32]。以上结果提示，CDK2抑制剂或许有望成为新一代顺铂耳毒性保护药物。总而言之，顺铂耳毒性发生率极高，严重影响肿瘤患者生活质量，尤其儿童患者。安全、有效、且不影响顺铂抗肿瘤疗效的顺铂耳毒性保护作用的研究将聚焦于新作用靶点药物的开发，借助药物递送系统提高疗效或两种不同作用机制药物的联合应用。

参考文献

1 Kanzaki S.Feasibility of Drug and Gene Therapy for Sensorineural Hearing Loss[J].Nihon Yakurigaku Zasshi,2013,141(4):188-190.

2 Frisina RD,Wheeler HE,Fossa SD,et al.Comprehensive Audiometric Analysis of Hearing Impairment and Tinnitus After Cisplatin-based Chemotherapy in Survivors of Adult-onset Cancer[J].J Clin Oncol,2016,34(23):2712-2720.

3 Yu X,Fan Z,Han Y,et al.Paeoniflorin Reduces Neomycin-induced Ototoxicity in Hair Cells by Suppression of Reactive Oxy-gen Species Generation and Extracellularly Regulated Kinase Signalization[J].Toxicol Lett,2018,285:9-19.

4 Mukherjea D,Jajoo S,Kaur T,et al.Transtympanic Administration of Short Interfering(si)RNA for the NOX3 Isoform of NADPH oxidase Protects Against Cisplatin-induced Hearing Loss in the Rat[J].Antioxid Redox Signal,2010,13(5),589-598.

5 Kim SJ,Ho Hur J,Park C,et al.Bucillamine Prevents Cisplatin-induced Ototoxicity Through Induction of Glutathione and Antioxidant Genes[J].Exp Mol Med,2015,47:e142.

6 Sheshadri P,Kumar A.Managing Odds in Stem Cells:Insights into the Role of Mitochondrial Antioxidant Enzyme MnSOD[J].Free Radic Res,2016,50(5):570-584.

7 Breglio AM,Rusheen AE,Shide ED,et al.Cisplatin is Retained in the Cochlea Indefinitely Following Chemotherapy[J].Nat Commun,2017,8(1):1654.

8 More SS,Akil O,Ianculescu AG,et al.Role of the Copper Transporter,CTR1,in Platinum-induced Ototoxicity[J].J Neurosci,2010,30(28):9500-9509.

9 Lanvers-Kaminsky C,Sprowl JA,Malath I,et al.Human OCT2 Variant c.808G＞T Confers Protection Effect Against Cisplatin-induced Ototoxicity[J].Pharmacogenomics,2015,16(4):323-332.

10 Thomas AJ,Hailey DW,Stawicki TM,et al.Functional Mechanotransduction is Required for Cisplatin-induced Hair Cell Death in the Zebrafish LateralLine[J].J Neurosci,2013,33(10):4405-4414.

11 Myrdal SE,Steyger PS.TRPV1 Regulators Mediate Gentamicin Penetration of Cultured Kidney Cells[J].Hear Res,2005,204(1-2):170-182.

12 Sheth S,Mukherjea D,Rybak LP,et al.Mechanisms of Cisplatin-Induced Ototoxicity and Otoprotection[J].Front Cell Neurosci,2017,11:338.

13 So H,Kim H,Kim Y,et al.Evidence That Cisplatin-induced Auditory Damage is Attenuated by Downregulation of Pro-inflammatory Cytokines Via Nrf2/HO-1[J].J Assoc Res Otolaryngol,2008,9(3):290-306.

14 刘宏伟,冷辉,孙海波.川芎嗪对顺铂耳聋大鼠耳蜗Fas/Fas L及caspase8的调控研究[J].中华耳科学杂志，201，13(2):335-335.Liu HW,Leng H,Sun HB.Effects of Ligustrazine on Expression of Fas/Fas L and Caspase 8 in Cochlea of Rat with Cisplatin-induced Hearing Loss[J].Chinese Journal of Otology,2015,13(2):335-335

15 翁宇航，陈飒，周金章，等。顺铂损伤后幼年斑马鱼侧线毛细胞STAT3的表达及意义[J].中华耳科学杂志,2016,14(6):808-812.Weng YH,Chen S,Zhou JZ,et al.STAT3 Expression During Cisplatin-induced Hair Cell Injury in the Lateral Line in Zebrafish Larvae.Chinese Journal of Otology,2016,14(6):808-812.

16 Sooriyaarachchi M,George GN,Pickering IJ,et al.Tuning the Metabolism of the Anticancer Drug Cisplatin with Chemoprotective Agents to Improve its Safety and Efficacy[J].Metallomics,2016,8(11):1170-1176.

17 Wimmer C,Mees K,Stumpf P,et al.Round Window Application of D-methionine,Sodium Thiosulfate,Brain-derived Neurotrophic Factor,and Fibroblast Growth Factor-2 in Cisplatin-induced Ototoxicity[J].Otol Neurotol,2004,25(1):33-40.

18 Wang J,Lloyd Faulconbridge RV,Fetoni A,et al.Local Application of Sodium Thiosulfate Prevents Cisplatin-induced Hearing loss in the Guinea Pig[J].Neuropharmacology,2003,45(3):380-393.

19 Berglin CE,Pierre PV,Bramer T,et al.Prevention of Cisplatin-induced Hearing Loss by Administration of a Thiosulfate-containing Gel to the Middle Ear in a Guinea Pig Model[J].Cancer Chemother Pharmacol,2011,68(6):1547-1556.

20 Freyer DR,Chen L,Krailo MD,et al.Effects of Sodium Thiosulfate Versus Observation on Development of Cisplatin-induced Hearing Loss in Children with Cancer(ACCL0431):A Multicentre,Randomised,Controlled,Open-label,Phase 3 Trial[J].Lancet Oncol,2017,18(1):63-74.

21 Brock PR,Childs M,Rajput K,et al.Two-year Results of Clinical Efficacy of Cisplatin in Combination with Sodium Thiosulfate(STS)Vs Cisplatin Alone in a Randomized Phase III Trial for Standard Risk Hepatoblastoma(SR-HB):SIOPEL 6[J].J Clin Oncol,2016,34:10514-10514.

22 Rushworth GF,Megson IL.Existing and Potential Therapeutic Uses for N-acetylcysteine:The Need for Conversion to Intracellular Glutathione for Antioxidant Benefits[J].Pharmacol Ther,2014,141(2):150-159.

23 Wu YJ,Muldoon LL,Neuwelt EA.The Hemoprotective Agent N-acetylcysteine Blocks Cisplatin-induced Apoptosis Through Caspase Signaling Pathway[J].J Pharm Exp Ther,2005,312(2):424-431.

24 Yoo J,Hamilton SJ,Angel D,et al.Cisplatin Otoprotection Using Transtympanic L-N-Acetylcysteine:A Pilot Randomized Study in Head and Neck Cancer Patients[J].Laryngoscope,2014,124(3):E87-94.

25 Riga MG,Chelis L,Kakolyris S,et al.Transtympanic Injections of Nacetylcysteine for the Prevention of Cisplatin-induced Ototoxicity a Feasible Method with Promising Efficacy[J].Am J Clin Oncol,2013,36(1):1-6.

26 Ciftci Z,Deniz M,Yilmaz I,et al.In Vitro Analysis of a Novel Controlled Release System Designed for Intratympanic Administration of Nacetylcysteine:A Preliminary Report[J].Am J Otolaryngol,2015,36(6):786-793.

27 Orgel E.NAC to Prevent Cisplatin-induced Hearing Loss,2014.ClinicalTrials.gov Web site.

28 Campbell KC,Meech RP,Rybak LP,et al.The effect of D-methionine on Cochlear Oxidative State with and Without Cisplatin Administration:Mechanisms of Otoprotection[J].J Am Acad Audiol,2003,14(3):144-156.

29 Ekborn A,Laurell G,Johnström P,et al.D-Methionine and Cisplatin Ototoxicity in the Guinea Pig:D-methionine Infuences Cisplatin Pharmacokinetics[J].Hear Res,2002,165(1-2):53-61.

30 Wimmer C,Mees K,Stumpf P,et al.Round Window Application of D-methionine,Sodium Thiosulfate,Brain-Derived Neurotrophic Factor,and Fibroblast Growth Factor-2 in Cisplatin-induced Ototoxicity[J].Otol Neurotol,2004,25(1):33-40.

31 Campbell KCM,Nayar R,Borgonha S,et al.In Oral D-methionine(MRX-1024)Significantly Protects Against Cisplatin-Induced Hearing Loss:A Phase II Study in Humans,Proceedings of the 32nd Annual Midwinter Research Meeting Association for Research in Otolaryngology,Baltimore,Maryland,USA,Feb 14-19,2009.

32 Teitz T,Fang J,Goktug AN,et al.CDK2 Inhibitors as Candidate Therapeutics for Cisplatin-and Noise-induced Hearing Loss[J].J Exp Med.2018 Mar 7.