四逆汤保护心肌的实验研究进展

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四逆汤为温里剂，由附子、甘草、干姜配伍组成，具有回阳救逆之功效。《素问·生气通天论》：“阳气者，精则养神，柔则养筋。今心阳衰微，神失所养，则神衰欲寐；肾阳衰微，不能暖脾，升降失调，则腹部吐利”。临床常用于治疗心力衰竭[1]、冠心病[2]、心肌梗死[3]等心脏疾病，近年来大量学者对四逆汤的保护心肌作用机制进行了研究。本研究从抗氧化应激、抗心肌细胞凋亡、调节免疫-炎症反应、抗心肌纤维化、改善血流动力学等方面，总结四逆汤保护心肌的实验研究，为经典方剂四逆汤作用机制的深入研究提供参考。

1 抗氧化应激

氧化应激是氧自由基在体内产生的一种负面作用，与心力衰竭、冠心病等心脏病的发生发展密切相关[4]。有研究表明，氧自由基在心力衰竭动物模型中显著增多，抵抗被氧化的能力降低[5]。当氧自由基抵抗物质活性下降或产生过度，可引起氧自由基沉积，刺激细胞膜脂质发生过氧化反应。丙二醛(MDA)是氧自由基刺激细胞膜发生过氧化反应的产物之一。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶系统可清除体内氧自由基，保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害[6]。

四逆汤有清除氧自由基和抗脂质过氧化的作用。四逆汤可提高急性缺血性心肌梗死大鼠血浆中SOD含量，降低MDA含量。但SOD含量与时间变化呈负相关，与MDA含量与此同时间变化呈正相关，提示减轻氧自由基损伤作用可能不是四逆汤抗急性缺血性心肌梗死的主要途径[7]。四逆汤降低肾阳虚、心阳虚、脾阳虚模型大鼠线粒体的MDA和心肌组织内乳酸含量，升高GSH-Px活性，增加GSH-Px/MDA比值，保护大鼠线粒体[8]。四逆汤可有效保护脓毒症大鼠心肌细胞线粒体功能，其机制可能与提高线粒体的抗氧化能力、减少氧化损伤、改善线粒体的呼吸功能有关[9]。四逆汤组可以显著改善心力衰竭大鼠心功能，使铜-锌SOD和锰SOD的活性提高，其mRNA的表达增加，心肌组织和心肌细胞线粒体MDA的含量明显减少[10]。一氧化氮(NO)是一种十分活泼的自由基，在人体内由L-精氨酸、氧分子和还原型辅酶(NADPH)Ⅱ经关键酶一氧化氮合酶(NOS)的催化产生[11]。当归加四逆汤调节大鼠血清中NO的含量，可有效抑制心肌缺血再灌注(MI/R)大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVEC)凋亡[12]。四逆汤可明显改善心肌纤维化大鼠心脏功能，减少心肌胶原含量，降低血清中MDA水平，提高NO水平及SOD活力，通过抑制心肌组织中Rho A和ROCK1蛋白的表达，使内皮型一氧化氮合酶蛋白的表达升高，减少氧化应激反应，实现抗心肌纤维化[13]。

2 抗心肌细胞凋亡

细胞凋亡是维持机体功能、形态不可或缺的，但过多或过少均可导致机体出现形态及功能的障碍，在心脏疾病中同样起着非常重要的作用。Bcl-2家族是调控细胞线粒体凋亡通路的蛋白家族，既促进细胞凋亡，如Bad、Bid、Bax；又抑制细胞凋亡如Bcl-2、 Bcl-x、Bcl-w。Bcl-2通过蛋白间相互作用调节线粒体外膜通透性，其与促凋亡蛋白Bax结合，可抑制Bax生物学活性，抑制细胞色素C(Cyt-C)和凋亡诱导因子(AIF)的释放，阻断下游分子Caspase的激活[14-15]。Caspase是一类同源蛋白酶，在细胞凋亡、活化及增殖中有重要作用[16]。Smac是存在于线粒体的蛋白质，当细胞受到凋亡刺激，Smac蛋白被释放到细胞质，抑制逆转凋亡抑制蛋白活性，Caspase活性提高，促进细胞凋亡[17]。四逆汤抑制细胞凋亡的线粒体信号转导通路，保护线粒体可能是其保护心肌细胞的机制之一。实验研究表明[18]，四逆汤可升高心肌缺血再灌注(MI/R)大鼠心肌细胞的蛋白激酶C(PKC)发生转位且蛋白表达，Smac自线粒体的释放减少，Caspase-3的活性下降。四逆汤有效部位可降低MI/R大鼠心肌神经酰胺的含量，抑制心肌细胞凋亡，起到保护心肌的作用[19]。四逆汤可以有效抑制由阿霉素(ADR)引起的心力衰竭大鼠心肌细胞胞浆中Cyt-C及AIF蛋白释放及Caspase-9和Caspase-3蛋白酶活性，Bcl-xl蛋白阳性反应物表达显著增加，Bid蛋白表达减少，抑制细胞凋亡[20]。

3 调节免疫-炎症反应

免疫-炎症反应与心脏疾病的发生、发展密切相关。白介素(IL)有IL-6、IL-8、IL-18等亚型，是由多种细胞产生的一类细胞因子，在传递信息、激活与调节免疫细胞及炎症反应中发挥重要作用。肿瘤坏死因子(TNF)是一种多功能细胞因子，分为TNF-α和TNF-β两种。TNF-α由中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等产生；TNF-β主要由活化的淋巴细胞产生。两者均可以诱导炎性反应、抗肿瘤、抗感染、调节免疫反应等[21]。四逆汤抑制细胞TNF-α的释放，降低细胞上清液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和TNF-α含量，显著抑制缺血缺氧大鼠心肌细胞H9C2的凋亡，提高心肌细胞存活率，保护心肌细胞[22]。在四逆汤中加入党参和黄芪组成的参芪四逆汤，可以明显改善大鼠心功能，降低胶原纤维含量，通过降低心肌TGF-β1和结缔组织因子(CTGF)的表达，起到防治心肌纤维化的作用[23]。四逆汤改善脓毒症晚期大鼠免疫功能状态，抑制炎症介质TNF-α、IL-10及肌钙蛋白T(cTnT)的释放，减轻脓毒症中晚期大鼠心肌细胞损伤[24]。氧化应激、细胞凋亡、炎症反应三者相互影响，炎症反应可增加氧自由基的生成，心肌细胞和活化间质胶原酶受损，间质胶原网络被破坏，炎症和氧化反应又进一步诱导细胞凋亡，而形成一个慢性的网络体系。

4 抗心肌纤维化

心肌纤维化是心血管系统疾病发展到一定阶段的共同病理变化，表现为心脏成纤维细胞过度增殖，间质纤维增生，胶原蛋白沉积，最终导致心肌的顺应性降低，心功能下降[25]。促进心肌纤维化的因子包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、CTGF、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、骨桥蛋白(OPN)及各种炎性因子；抑制心肌纤维化的因子包括肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白7(BMP-7)、过氧化酶体增殖物激活受体(PPAR)、磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)、脂联素(APN)、松弛素(RLX)[26]。还有研究显示，四逆汤明显降低心肌纤维化大鼠心肌间质胶原容积分数、心肌羟脯氨酸含量、心脏重量指数，其机制可能与升高心肌组织内PPAR蛋白表达、降低血浆中细胞间黏附分子(ICAM)1和TGF-β1水平有关[27]。Smads作为TGF-β受体胞内激活底物，除可介导TGF-β的信号转导外，还可引起其下游致心肌纤维化和心肌肥厚的信号转导[28]。四逆汤可降低心肌胶原纤维IOD值，有效抑制心肌纤维化，其机制是降低Smad2表达，升高Smad7表达[29]。

5 改善血流动力学

血流动力学异常会增大心脏收缩和舒张压力负荷，损伤心肌细胞，还可引起心肌及血管内皮细胞炎症反应，损伤心肌细胞及心肌纤维细胞。左室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmin)是常见的评价心脏收缩和舒张功能指标。四逆汤可改善心力衰竭大鼠的心功能，且可以改善大鼠心率、LVSP、左室舒张末期压力(LVEDP)、+dp/dtmax和-dp/dtmin等血流动力学指标[30]。四逆汤可保护甲状腺功能减退症的心血管系统损害，明显降低血清三酰甘油(TG)、血清胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，显著升高心钠素(ANP)、血清内皮素(ET)水平[31]。刘颖等[32-33]对四逆汤预处理心肌缺血再灌注大鼠的研究发现，四逆汤可减小大鼠心肌梗死面积，使血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、MDA的含量降低，NO2-/NO3-含量提高，上调热休克蛋白70基因、核因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶p38和PKC发生转位及蛋白表达。三磷酸腺苷(ATP)是生物体内最直接的能量来源，其含量异常会发生心肌收缩功能障碍，导致心肌细胞死亡[34]。四逆汤能使慢性心力衰竭大鼠心肌ATP的含量增加，调节心力衰竭大鼠心肌的能量代谢，控制慢性心力衰竭的发展[35]。

四逆汤是《伤寒论》中温补心肾，通脉止痛的代表方，大量临床和动物实验表明其可增强心脏功能，保护缺血心肌[36]。近年来随着分子生物学的不断发展，对四逆汤保护心肌的作用机制的研究，在氧化应激、细胞凋亡、抗炎等方面取得了一定进展，但研究内容不够完善，细胞通路、神经调节因子还有待进一步系统研究。