NGAL及NGALR在肾脏纤维化进程中的作用

王瑞芳,尹 敏,范 卉,李倩玉,刘 锋

(吉林大学中日联谊医院 肾内科,吉林 长春130033)

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是Kjeldsen等[1]1993年研究人类中性粒细胞时首先发现,它与92 kD的明胶酶-B即基质金属蛋白酶9(MMP-9)密切相关,是一个分子量只有25 kD的分泌型糖蛋白。大量研究发现,急性肾损伤(AKI)早期NGAL水平即迅速升高,与肾脏损伤分子(KIM-1)、血肌酐(Scr)、尿N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)等AKI标志物相比优势明显,具有快速、灵敏、特异等生物学特点,可作为早期检测AKI的生物学标志物,并对肾脏有保护作用。但NGAL是否在慢性肾脏病(CKD)进程中也发挥一些作用目前还无明确系统阐述。目前研究发现了NGAL在糖尿病肾病[2]、肾病综合征[3]、狼疮性肾炎[4]、IgA肾病[5]、多囊肾[6]等多种CKD疾病进展中表达。近年来有实验研究NGAL及NGALR在肾脏纤维化进程中所发挥的作用,本文就此相关研究进展作一综述。

1 NGAL及其受体NGALR

NGAL：NGAL也被称作24p3、Lipocalin2(Lcn2)、Siderocalin、NRL或SIP24等,属于Lipocalin家族,可能与炎症反应、免疫调节、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤发生发展等有密切关系。生理条件下NGAL少量表达于骨髓中性粒细胞,且只在中幼粒及晚幼粒细胞阶段合成。NGAL也表达于人体很多组织中,在前列腺、肝脏、胃、结肠、乳腺等以低水平表达,而在脑和周围神经等组织细胞中表达呈阴性[7]。缺血、肾损伤、炎症、感染等因素能上调NGAL的表达[7],NGAL可在其他组织中大量生成。正常情况下NGAL在肾组织呈低表达状态,大量研究证实主要在近端小管表达,同时也存在于远端肾单位。有研究[8]发现了24p3样大鼠同源物α2μGRP于大鼠肾小球系膜细胞(MC)表达。Lee等[9]研究证明了小鼠足细胞表达Lcn2/NGAL,IL-6能激活足细胞Lcn2/NGAL的表达。而受缺血性损伤的小鼠肾脏中NGAL还可典型地表达于致密斑[10]。NGAL调控肾小管上皮细胞的凋亡,当上皮细胞受到刺激时,受损的远端肾小管、集合管分泌NGAL增强,且表达量与肾小管的损伤程度密切相关[10],诱导增殖浸润的中性粒细胞发生凋亡,以免肾组织受到炎细胞侵害。NGAL能够结合一些配体,其中最重要的是铁载体,其它还包括MMP-9、肝细胞生长因子(HGF)及蛋白激酶等。

NGALR：Devireddy等[11]在鼠淋巴细胞系来源的FL5.12细胞中发现24p3的特异性细胞表面受体24p3R,并找到相对应的人类同源物NGAL受体,NGALR。目前已经明确的NGAL受体,一种是NGALR选择性剪接变异体NGALR1,即megalin受体(NM_020372),低分子密度脂蛋白受体家族的一员,为NGAL非特异性蛋白结合体[12],是介导多配体内吞的单跨膜受体。另一种是NGALR2,它是高度保守的24p3R人同源物(NM_016609),脑型有机阳离子转运蛋白家族的一员,与NGAL特异结合[11]。2007年Fang等[13]在分析食管癌细胞系中NGAL受体的表达时,确定了一种新的1438bp较短的cDNA片段,NGALR3(DQ_658848)。有研究发现[14]NGALR在人肾脏的近曲小管上皮强阳性表达,肾单位的其它部分与肾小球为中等阳性表达。之后有学者[15]证实了NGALR在人肾小球的表达区域主要分布在系膜细胞上,NGAL可通过与NGALR结合进入系膜细胞。NGALR阳性表达于细胞膜或细胞质。24p3-24p3R介导铁转运途径,结合了铁的24p3通过24p3R的胞吞作用进入细胞,调节细胞内铁水平变化,起到保护肾脏、调控细胞凋亡的作用。24p3R还介导远端肾单位上皮细胞铁螯合,发挥抑菌作用。

2 NGAL及NGALR和肾脏纤维化

肾脏纤维化是各种CKD进展到终末期肾病的共同通路,包括肾小球硬化和肾间质纤维化(RIF)。其主要病理改变表现为肾间质成纤维细胞增生和细胞外基质(ECM)在肾间质中过度积聚。肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)是导致RIF发生的核心病理过程。肾小管上皮细胞可通过EMT转分化为肌成纤维细胞,进入间质,合成ECM,而阻断EMT可以抑制RIF进程。受损伤肾脏主要的促纤维化细胞为肾小球MC、间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞[16]。损伤刺激引起肾脏固有细胞活化,释放大量趋化因子,如单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、调节活化正常T细胞分泌因子(RANTE)等,吸引循环中炎性细胞浸润到损伤部位,产生有害分子,上述物质又刺激促纤维化细胞表型的活化或转变,从而产生大量的ECM。NGAL可通过与NGALR结合进入细胞而发挥生物学作用,NGAL的功能受到NGALR表达抑制的直接影响,因此NGALR的表达对研究NGAL在慢性肾脏疾病中的生物学意义也是非常重要的。近年来研究表明,NGAL及NGALR可通过不同的信号通路或途径调节纤维化相关因子的表达水平,从而参与肾小球硬化和RIF。NGAL及NGALR可能通过以下的几个方面参与肾脏纤维化的发病过程。

2.1 NGAL和MMP-9

基质金属蛋白酶家族(MMPs)能够降解ECM和肾小球基底膜(GBM),组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能够与特异MMPs家族成员结合形成MMPs-TIMP复合体抑制其活性,从而控制ECM的降解、组织重塑等。NGAL是在研究MMP-9时被发现的,它是活化的中性粒细胞中释放的多功能蛋白,通过二硫键与MMP-9结合形成复合物,以此调节MMP-9的活性,并保护MMP-9不被降解。有研究显示[17],在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏NGAL表达阳性程度与肾小管间质损伤指数及MMP-9始终呈显著正相关,提示NGAL可能与MMP-9在UUO大鼠肾脏中作用相似。MMP-9在肾小球高度表达,主要降解IV型胶原(Col)和明胶。MMP-9可使ColIV释放可溶性羟脯氨酸,降解完整的GBM,MMP-9活性水平直接影响ColIV的表达和局部沉积,调节肾脏纤维化的过程。TIMP-1为MMP-9的特异抑制剂,MMP-9/TIMP-1是参与ECM降解的重要酶系,而NGAL同MMP-9和TIMP-1形成三元复合物,某种程度上来说,NGAL可抵消复合物中TIMP-1对MMP-9的活性抑制作用,从而抑制肾脏纤维化。

2.2 NGAL及NGALR和NF-κB

核因子κB(NF-κB)可以调控多种炎性因子和趋化因子的表达,参与成纤维细胞的增殖分化、ECM交联及细胞凋亡等过程。IκB为NF-κB的抑制蛋白,而IκBζ是非典型的IκB蛋白的其中一种。序列分析发现,在NGAL基因5'侧翼转录调控区有典型的转录激活因子NF-κB的结合元件。Iannetti等[18]研究发现,在衍生自人未分化甲状腺癌细胞(FRO细胞)中,IκBζ和NF-κB的p50及p52亚基一起结合于NGAL的启动子,激活NGAL,NF-κB通过诱导因子IκBζ调控NGAL的表达。在人结直肠癌细胞系中研究发现[19],Lcn2高表达与NF-κB的表达呈负相关,Lcn2可抑制NF-κB向核内转运。Lcn2作用于NF-κB/snail信号通路的上游,可通过减弱NF-κB的启动子活性而显著抑制NF-κB/snail信号通路诱导的EMT。在肾脏中,NF-κB通路激活后可通过诱导炎症反应直接参与EMT、RIF,由此推测NGAL在肾脏中可能也是肾小管EMT重要的负调控因子。还有研究发现[20],高糖可激活大鼠肾小球MC中Toll样受体-4(TLR4)/NF-κB p65通路,上调NGAL mRNA及蛋白表达,同时伴有炎症因子[MCP-1、趋化因子配体5(CXCL5)]及纤维化因子[纤连蛋白(FN)、结缔组织生长因子(CTGF)]表达水平升高,参与肾脏炎症反应及纤维化改变。Langelueddecke等[21]研究证明,24p3R可以介导蛋白质内吞,特别是白蛋白。发生蛋白尿时,异常增多的血浆蛋白竞争结合NGALR,NGALR介导蛋白细胞内吞,远端肾单位接触高浓度白蛋白,随后激活NF-κB通路,诱导TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IκBα和RANTES表达水平增加,参与进一步相关反应[22]。

2.3 NGAL及NGALR和TGF-β1

转化生长因子-β1(TGF-β1)能引起肾小管EMT,是致肾脏纤维化的重要生长因子,过度表达可使肾组织ECM过度积聚。TGF-β1对ECM的影响机制主要有：①通过TGF-β1/Smad信号传导通路,增加MC增殖和ECM分泌,这在肾脏纤维化中起核心作用。②抑制MMPs活性,减少ECM的降解。有研究显示[18],在UUO大鼠肾脏NGAL水平与肾小管间质损伤程度及TGF-β1表达程度在RIF过程早期阶段(术后3-7 d)呈明显正相关,在晚期阶段 (术后14-28 d)呈显著负相关,提示NGAL与TGF-β1致纤维化的作用关系密切。有体外研究[23]发现,在分别用0,1,5,10和20 ng/ml的TGF-β1处理正常大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E),NGAL mRNA的表达水平随TGF-β1的浓度上升而下降,且在5和10 ng/ml时变化最显著,而用抗TGF-β1抗体中和后,NGAL mRNA的表达恢复到控制水平(0 ng/ml)。由此可推测,TGF-β1可以抑制NGAL的表达,从而参与肾脏纤维化,相反NGAL具有一定的抑制肾脏纤维化的作用。TGF-β1还参与下调24p3R表达,减少肾小管的蛋白负荷,当24p3R表达受抑制后,TGF-β1、锌指转录因子(Snail)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SAM )mRNA的表达在24p3R缺失细胞中明显减少[22]。

2.4 NGAL及NGALR和Ras-MAPK、MAPK/ERK

钙依赖性跨膜糖蛋白( E-cad)广泛存在于机体上皮组织,介导同种细胞间相互黏附,有助于维持正常上皮细胞形态和组织结构完整性。Yang[24]等通过小鼠实验,将表达24p3的输尿管芽细胞处理分离,推断NGAL通过增强E-cad表达,阻止RIF。Ras诱导多个下游效应,它可激活丝/苏氨酸蛋白激酶(Raf),继而激活丝裂原细胞外激酶(MEK),导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化,同时Ras还可介导其他信号传导通路。Jun-ichi Hanai等[25]研究发现,在同基因型自发迁移乳腺癌模型细胞(4T1细胞)中,使用纯化的NGAL作用于R细胞(4T1-Ras细胞),Ras诱导的Raf、MEK和胞外信号调控激酶(ERK)1/2磷酸化消失了,但Ras总的表达水平不变,同时还发现NGAL作用于MEK的上游区,说明NGAL可以调节Ras-MAPK途径,且作用位点在Ras和Raf之间。此外,NGAL干预Ras-MAPK之外的信号通路不足以抑制Ras诱导的EMT,进一步证明NGAL可以通过Ras-MAPK信号通路抑制Ras诱导的EMT。研究还发现,Ras-MEK是EMT必不可少的,MEK活化是EMT的关键,它促进E-cad磷酸化和降解,MEK抑制剂和NGAL可以抑制Ras诱导的EMT,明显减少E-cad磷酸化,同时提高E-cad蛋白的表达水平。而在这过程中,NGAL既不影响E-cad mRNA的水平,也不增强E-cad启动子的转录活性,表明这一过程是通过转录后效应实现的。Mao等[16]体外实验研究结果证明,IL-1β通过激活MAPK/ERK通路上调人系膜细胞(HMC)的NGALR表达,且这种升高可以被ERK的活性抑制剂所抑制。同时在HMC中能检测到NGAL mRNA的表达,但无蛋白翻译,并且IL-1β能诱导NGAL mRNA表达增加。但加入外源性NGAL后,则能在HMC中检测到NGAL蛋白的表达。NGAL通过NGALR被摄入MC内,诱导HMC上调FN、ColIV和CTGF的表达水平,参与肾脏纤维化。

2.5 NGAL和HGF

在肾脏中,HGF由肾小球MC、内皮细胞及间质成纤维细胞等间质来源的细胞生成。HGF主要通过抑制TGF-β1的产生或阻断TGF-β1/Smad通路负性调控EMT,是一种重要的抗纤维化因子。有研究[26]发现,在小鼠肾脏内髓集合管-3细胞(mIMCD-3细胞),HGF可以刺激上皮细胞表达NGAL增加。而分泌的NGAL可以直接与HGF结合,降低HGF与其受体c-Met结合的能力,减少下游信号活化,显著抑制HGF刺激肾小管上皮细胞过度迁移和分化的能力。还有实验研究发现[27],采用UUO致RIF的大鼠模型,肾脏损伤后HGF和NGAL都于早期表达升高,RIF形成后两者表达下降,NGAL与HGF的水平呈正相关。而促肝细胞生长素(pHGF)能使肾组织中HGF的表达增加,维持E-cad的表达,并促进NGAL的表达,减轻UUO大鼠RIF的程度。二者在肾脏损伤修复过程中协同抑制RIF。

NGAL主要在近端肾小管表达,也有实验发现了NGAL的同源物表达于系膜细胞、足细胞、致密斑,NGALR在肾小球的表达区域主要分布在MC上,NGAL可与NGALR结合进入MC而发挥生物学作用。在肾脏纤维化进程中,NGAL可以抑制促纤维化因子的表达,提高抗纤维化蛋白的活性,从而一定程度上抑制肾脏纤维化,起到对肾脏的保护作用。从NGAL着手,或许有益于研制促进NGAL活性或表达的药物,从而延缓肾脏纤维化的进展,达到治疗慢性肾脏病的目的。但肾脏纤维化过程涉及到很多细胞、ECM、细胞因子等的参与,各种因素相互作用及调控,还需要进一步研究。

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