姜黄素拮抗LPS活化巨噬细胞对胰岛β细胞的损伤

史立言，刘 岩，陈 为，孟繁平，李 妍*

(1.吉林医药学院检验学院,吉林 吉林132013;2.延边大学医学院,吉林 延吉133002)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病，虽然糖尿病的病因和发病机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明，免疫损伤因素参与胰腺的损伤[1]。胰岛主要是由4类内分泌细胞组成，分泌胰岛素的 β细胞组成胰岛核心,而α、δ及 PP细胞组成胰岛外壳。胰腺是血管密集、血供丰富的器官，当巨噬细胞(macrophage,Mφ)被趋化而浸润入胰岛微环境，可分泌细胞因子及释放NO等，参与β细胞损伤。感染、代谢和损伤因素刺激下，Mφ的极化将导致其分泌细胞因子和功能的改变[2]。细菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)结合Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR-4)而活化Mφ，姜黄素(curcumin)具有抗炎效应[3]。本研究将探讨其是否可通过调节Mφ极化而减轻活化巨噬细胞对胰岛β细胞的损伤。

1 材料与方法

1.1材料小鼠细胞巨噬细胞RAW264.7和小鼠胰岛β细胞Min-6保存于液氮中。1640培养液、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自Gibco公司。PE荧光素标记抗小鼠CD40、CD86和CD206的抗体购自天津三箭生物技术有限公司；LPS和活性氧(ROS)荧光探针双氯荧光黄乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)溶液购自上海碧云天生物科技有限公司；双染凋亡检测试剂盒和酶联免疫吸附技术(ELISA)检测小鼠TNF-α试剂盒购eBioscience公司。姜黄素购自Sigma Aldrich公司。

1.2细胞培养和处理复苏液氮冻存RAW 264.7细胞，在含10% 小牛血清1640培养液、5% CO2、饱和湿度37 ℃培养；用含0.25% 胰蛋白酶和0.2% 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 的消化液消化细胞，每周传代2-3 次，取对数生长期细胞用于实验。按1×106/孔接种细胞于6孔培养板，按如下分组加入LPS和姜黄素:对照组(control)，脂多糖(LPS)组(2 μg /mL)，姜黄素(curcumin)组(7.5 μmol/L ) 和联合处理组(2 μg /mL LPS+ 7.5 μmol/L curcumin) 。继续培养细胞24 h，收集培养物上清液于-20℃冻存，消化并收集细胞，完成后续实验。复苏并培养Min-6细胞，按1×106/孔接种于6孔培养板，细胞恢复贴壁生长后，按25%比例加入不同实验分组处理后的RAW 264.7细胞上清液，不添加RAW 264.7细胞上清液组为对照组；继续培养24 h后，消化收集Min-6细胞，完成后续实验。

1.3免疫荧光染色和流式细胞术取不同处理因素作用后的RAW264.7细胞，每组 5×105个细胞，悬于100 μl PBS，加入1 μg FITC 标记抗CD 40抗体或阴性对照抗体，4 ℃下避光反应30 min。PBS洗2次后用400 μl的PBS重悬细胞，流式细胞仪检测阳性表达细胞百分率。相同的方法检测CD86和CD206表达。

1.4ROS检测取不同处理因素作用后的RAW264.7细胞，每组 5×105个细胞，悬100 μl PBS ，加入DCFH-DA 储存液，至其终浓度为 5 μmol/L，混匀后在 37 ℃避光反应 30 min，PBS洗2次，400 μl PBS 重悬细胞，流式细胞仪分析细胞内荧光，以荧光强度均值代表细胞内ROS含量。

1.5ELISA取不同处理因素作用的RAW 264.7 细胞上清液，按照 ELISA 试剂盒操作说明测定 检测TNF-α含量，每个处理因素设3个复孔。

1.6细胞凋亡检测取不同处理因素作用后Min-6细胞，每组 5×105个细胞，用195 μl结合缓冲液重悬细胞，加入 5 μl Annexin-V-FITC 工作液，室温下避光反应 30 min；结合缓冲液洗涤细胞2次，400 μl结合缓冲液重悬细胞，加入PI 溶液5μl,立即上机用流式细胞仪分析。

2 结果

2.1LPS和姜黄素对RAW264.7细胞膜分子表达的影响

实验结果表明，LPS和姜黄素对RAW264.7细胞膜分子CD40、CD86和CD206的表达均有影响(表1)。与对照组比较，脂多糖组CD40和CD86表达增加，而CD206表达减少；姜黄素组CD206表达明显增加，CD40和CD86略下降。与脂多糖组比较，联合处理组CD206表达略增加，CD40和CD86下降。

表1 LPS和姜黄素对RAW264.7细胞膜分子表达的影响

*与对照组(control)比较，P<0.05**与脂多糖组(LPS)比较，P<0.05

2.2LPS和姜黄素对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

通过检测发现，LPS可促进RAW264.7释放TNF-α入细胞培养上清液，而姜黄素处理后，细胞分泌TNF-α较脂多糖组明显减少(表2)。

表2 LPS和姜黄素对RAW264.7分泌TNF-α的影响

*与对照组(control)比较，P<0.05**与脂多糖组(LPS)比较，P<0.05

2.3LPS和姜黄素对RAW264.7细胞活性氧的影响

ROS主要由细胞内线粒体产生，巨噬细胞在活化、吞噬和杀伤病原体的过程中伴随ROS增加[4]。通过荧光探针法检测细胞活性氧，对照组(control)，脂多糖(LPS)组(2 μg /mL)，姜黄素(curcumin)组(7.5 μmol/L ) 和联合处理组代表ROS含量的荧光强度值分别为12.4±1.3，25.7±2.8，9.7±0.9和11.6±1.0(图1)。分析表明，LPS导致细胞内ROS显著增加，而低浓度的姜黄素对细胞内ROS仅有弱的减少效应(与对照组比较P<0.05)；但姜黄素能能显著减少LPS激发的活性氧(与脂多糖组比较P<0.05)。

图1 LPS和姜黄素对RAW264.7细胞活性氧的影响

2.4姜黄素拮抗LPS活化巨噬细胞对Min-6细胞的损伤

采用双染法检测Min-6细胞凋亡情况，用新鲜培养液培养组作为空白组(blank),而添加不同条件培养液组对应命名，即对照组(control)，脂多糖(LPS)组(2 μg/mL)，姜黄素(curcumin)组(7.5 μmol/L ) 和联合处理组(LPS +curcumin)。

3 讨论

糖尿病发生发展的核心是胰岛β细胞的功能障碍[5]。多项研究显示，多种炎症因子可对胰岛β细胞造成损伤，包括TNF-α、IFN-γ和IL-1β等[6]，损伤的胰岛β细胞刺激巨噬细胞活化，致使其分泌更多的炎性因子，进一步加重胰岛细胞的损伤[7]。因此，抑制巨噬细胞活化，使其向调节性分化，可能成为糖尿病的治疗手段之一。姜黄素是一种从姜科、天南星科植物的根茎中提取出的一种成分，是传统中药姜黄的主要成分，其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及降血脂等作用[8]。研究表明，它不仅能够抑制巨噬细胞活化，而且具有使已活化的巨噬细胞向调节型转变的功能[9]。LPS是细菌细胞壁的主要成分，可刺激巨噬细胞活化，产生炎症[10]。本研究中，利用LPS诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7，使其发生M1型极化，并以其产生的含有炎症因子的培养液上清作用于小鼠胰岛Min-6细胞，模拟体外炎症损伤模型。结果显示，LPS使Raw264.7细胞膜分子CD40和CD86表达均有增加，而CD206表达减少，且TNF-α分泌增加，细胞内ROS增加，表明成功建立炎症模型；而加入姜黄素后，以上指标的变化明显减弱甚至被逆转。将M1极化后的Raw264.7培养上清加入Min-6细胞后，以姜黄素干预后的炎症模型与之对比，双染凋亡结果显示，Min-6细胞受到M1极化的巨噬细胞炎症因子刺激，凋亡比例明显增加，而姜黄素可显著抑制其损伤作用，提示姜黄素可能拮抗巨噬细胞的活化，保护炎性因子对胰岛细胞的损伤。

图2 姜黄素拮抗LPS活化巨噬细胞对Min-6细胞的损伤

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