利用非天然氨基酸代谢掺入法检测新生成蛋白

崔秀雲 孙宁宁 谢小娜 孙万春 赵晴 刘宁

摘 要 以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）为模型体系，建立了非天然氨基酸代谢掺入法检测特定新生成蛋白的方法。通过代谢掺入的方法，使细胞中的蛋白质，特别是新生成的蛋白质一级结构中掺入非天然氨基酸，即带有叠氮基团的甲硫氨酸类似物（Azidohomoalanine，AHA）。考察了在不同浓度的LPS和FBS，以及不同的刺激时间等条件下，LPS刺激Raw264.7细胞产生TNF-α的实验参数，确定了最优的实验条件为： 在含有1%胎牛血清的无甲硫氨酸（Met）的DMEM培养基中，分别在不加LPS和加10 ng/mL的LPS条件下刺激Raw264.7细胞4 h，在刺激细胞的同时掺入AHA。利用Cu+催化的叠氮基团与带有生物素（Biotin）标签的炔烃基团的环加成反应，使蛋白质标记上Biotin标签。利用吸附在固相载体上的抗体特异性捕获TNF-α分子，再用耦联辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）的链霉亲和素（Streptavidin）对TNF-α分子上的Biotin进行识别，实现对特定的新生成蛋白质（TNF-α）进行检测。本方法为检测特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白质的周转等研究提供了新的思路法。

关键词 新生成蛋白；非天然氨基酸；肿瘤坏死因子α；点击化学

1 引 言

蛋白质是细胞中最主要的组成部分，几乎参与所有的生命过程。正常以及病理状态的细胞，都会通过蛋白质的合成与降解、翻译后修饰等维持正常细胞生理状态及快速适应环境变化[1]。因此，对蛋白质进行活体标记，进而研究新生成蛋白质、表征蛋白质的代谢状况具有重要意义[2，3]。

通过代谢掺入方式，可以利用非天然氨基酸对新生成的蛋白质进行标记。非天然氨基酸是指自然界不存在的、由人工合成的氨基酸，例如带有叠氮基团的甲硫氨酸类似物（Azidohomoalanine，AHA），它可以在细胞的正常蛋白质合成过程之中掺入到蛋白质的一级结构中，在细胞中无偏爱性，无毒性，也不会引起蛋白的降解[4，5]。当非天然氨基酸成功掺入细胞后，利用Cu+催化的叠氮与炔基的环加成反应（Copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition， CuAAC）[6]，使细胞中新生成的蛋白质标记上生物素（Biotin）等标签，进而富集，并利用质谱技术对新生成蛋白进行鉴定[7，8]；或者将新生成的蛋白质标记上荧光分子，从而可以利用影像学技术对新生成蛋白在细胞内的分布状态进行直接观察[9，10]。

目前，该领域大多数的工作集中在对特定条件下的新生成蛋白进行整体的组学研究，即所研究的对象和目标分子为一组蛋白质混合物（蛋白质组）[7～10]。而对特定目标蛋白分子的新生成情况尚没有较为成熟的分析方法。本研究将抗体-抗原反应的特异性与代谢标记方法有机地结合，首先，将非天然氨基酸AHA通过细胞自身的蛋白质合成机制掺入到蛋白质中，使新生成蛋白质上携带上Biotin标签；再利用抗体将特定目标蛋白分子特异性捕获，采用耦联辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）的链霉亲和素对目标蛋白分子上的Biotin进行识别，达到对特定的新生成蛋白质进行检测的目的。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ELx50洗板机（美国BioTek公司）；Tecan SUNRISE酶标仪（瑞士Tecan公司）；CO2培养箱（美国 Thermo 公司）；96孔培养板和24孔培养板（美国Costar公司）；AllegraTMX-22R Centrifuge离心机（美国Beckman Coulter公司）；Tanon6200 化学发光成像仪（Tanon公司）。

不含甲硫氨酸（Met）的DMEM培养基（DMEM（-），Gibco公司）；胎牛血清（FBS， Hyclone公司）；青霉素和链霉素混合物（PS）、磷酸盐缓冲液（PBS）（康宁公司）；Azidohomoalanine（AHA， 美国AnaSpec公司）；BIOTIN alkyne（美国Lumiprobe公司）；Tris（3-hydroxypropyltriazolylmethyl）amine（THPTA， 美国Clickchemistrytools公司）；Lipopolysaccharide（LPS）、Met（≥99.5%，）、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（Carbonated-bicarbonate），CuSO4（≥99.99%）（美国Sigma-Aldrich公司）；蛋白酶抑制剂（Roche 公司）；核酸酶（美国GE Healthcare 公司）；抗坏血酸钠（美国ACROS Organics 公司）；生物素标记的辣根过氧化物酶（Biotin-HRP， 美国Thermo Scientific公司）；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（SA-HRP， 美国Invitrogen 公司）；抗肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor α， TNF-α）抗体、生物素-抗TNF-α抗体、TNF-α标准品、TMB 底物（美国Bioscience公司）；ECL化学发光试剂（美国Thermo Scientific公司）；Raw264.7细胞购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。

2.2 Raw264.7细胞的培养、非天然氨基酸摻入及LPS刺激实验

将Raw264.7细胞在含有10% FBS和1% PS的DMEM培养基中培养。当细胞密度达到80%左右时，将细胞铺到24孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，以恢复细胞形态。次日，弃掉24孔板中的培养基，用提前预热的PBS清洗细胞，然后用DMEM（-）培养基在37℃，5% CO2培养箱中继续培养细胞1 h。弃掉24孔板中的培养基，用含有不同浓度LPS的DMEM（-）培养基对细胞进行培养，同时掺入4 mmol/L AHA或Met，37℃、5% CO2培养箱中培养4 h或6 h。

2.3 蛋白质提取及点击化学反应

弃去培养基后，用PBS清洗细胞3次，再用细胞刮子收集细胞至新的离心管中，以500 g离心10 min。 弃上清液，用PBS（含1% SDS）裂解细胞，并加入适量蛋白酶抑制剂和核酸酶。然后将细胞裂解液煮沸10 min，离心，收集上清液。用PBS稀释10倍后，向样品中加入适量THPTA、抗坏血酸钠、CuSO4、Biotin alkyne。高速涡旋混匀后，4℃避光反应过夜[6]。

2.4 ELISA法测定TNF-α

用0.05 mol/L碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）将抗TNF-α抗体稀释1000倍，加入 96孔板中，每孔100 μL，4℃孵育过夜。弃去孔中的液体后，用含有0.5% Tween-20的PBS（PBST）清洗3次。用含有0.5% BSA和0.1% Tween-20的PBS封闭，室温孵育1 h。经清洗后，每孔加入100 μL样品，37℃孵育2 h。弃去上清液，经清洗后，加入适量稀释的生物素-抗TNF-α抗体，37℃孵育1.5 h。用PBST清洗96孔板3次，每孔加入100 μL经适当稀释的SA-HRP，37℃孵育1 h。充分清洗96孔板后，每孔加入100 μL TMB底物反应液，37℃避光孵育20 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应后，在酶标仪上测定450 nm处各孔吸光度。以系列梯度稀释的TNF-α为标准品，在上述同样条件下测定，以TNF-α各孔吸光度对其浓度作图，绘制标准曲线。

2.5 Western blot检测

将样品与SDS上样缓冲液混匀，煮沸10 min，冷却至室温，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用湿转方法，冰浴条件下将凝胶上的样品转移至PVDF膜上。转膜后，先用含有5% BSA的TBST（50 mmol/L Tris-HCl （pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20）将膜在室温孵育2 h。清洗后，用适量稀释的一抗或HRP与膜在4℃孵育过夜。与经适量稀释的二抗在室温条件下孵育2 h后，用TBST清洗，经化学发光（CL）成像后分析结果。经SA-HRP孵育过夜的膜，用TBST清洗后，直接采用CL成像，分析结果。

2.6 标记Biotin的TNF-α的检测

抗体在96孔板上的包被、封闭、清洗及上样等步骤与2.4 节中的步骤一致，待加完样品于37℃孵育2 h后，弃去上清液，经清洗，加入适量稀释的SA-HRP，37℃孵育1 h。充分清洗96孔板后，每孔加入100 μL TMB底物反应液，37℃孵育20 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应。使用酶标仪测定450 nm处各孔吸收值。同时，以系列梯度稀释（8×105、1.6×106、3.2×106、6.4×106和1.28×107倍稀释）的Biotin-HRP（1 mg/mL）为标准品，直接包被，经封闭、清洗后，利用SA-HRP测定各孔450 nm处吸光度，以Biotin的浓度对吸光度作图，绘制标准曲线。

3 结果与讨论

3.1 实验参数优化及方法建立

Raw264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞，在药物开发、免疫机理、信号通路等研究中应用广泛。Raw264.7细胞易于培养，且当细胞在外界刺激（病原体入侵或者药物刺激）下，能够分泌多种细胞因子，如白介素-1β、白介素-6、TNF-α等[11～13]。本研究以LPS刺激Raw264.7细胞产生TNF-α[14～16]为体系，对实验条件进行了优化，首先考察了LPS浓度、LPS的处理时间对实验结果的影响。由于AHA与Met相互竞争掺入蛋白分子，为了最大程度提高AHA代谢掺入的效率，必须尽量减少培养基中所含有的Met。因此，本研究共使用了3种不同的培养基，分别为不含Met的DMEM培养基（DMEM（-））、含Met 的DMEM培养基（DMEM（+））、含AHA的DMEM培养基（DMEM（*））。初步研究结果表明，LPS刺激Raw264.7的最佳时间是6 h， 能够产生最大浓度的TNF-α。而通常利用AHA代谢掺入的时间在2～4 h时，已经足以检测到标记蛋白产物，而掺入时间过长有可能会对细胞的正常生理过程产生影响，因此在不添加FBS的情況下，分别用DMEM（-）、DMEM（+）和DMEM（*）培养Raw264.7细胞，同时加入不同浓度的LPS，分别培养4 h和6 h后，收集上清液，ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度。

如图1所示，当用DMEM（-）培养基时，LPS刺激细胞后所产生的TNF-α浓度都比较低，且刺激6 h所产生的TNF-α浓度比刺激4 h所产生的TNF-α浓度低，说明培养基中不含有Met或者Met类似物时，对细胞的生理活性影响很大，且时间越长，影响越大。当掺入Met时，LPS刺激细胞4 h和6 h所产生的TNF-α浓度很高，且趋势相似，说明掺入Met的DMEM培养基对细胞的生理活性影响很小，且不随时间长短发生变化。当掺入AHA时，LPS刺激细胞所产生的TNF-α浓度也比较低，且刺激6 h所产生的TNF-α浓度低于刺激4 h所产生的TNF-α浓度，说明AHA对细胞的生理活性有一定的影响，且时间越长，影响越大。因此，本研究选择LPS刺激的时间为4 h。

考察了LPS在1% FBS时刺激Raw264.7细胞4 h所产生的TNF-α浓度。当DMEM（-）培养基中含有1%血清时，用不同浓度的LPS刺激Raw-264.7细胞4 h，同时掺入Met或AHA。收集上清液，ELISA法检测上清液中的TNF-α浓度，结果如表1所示。当不加LPS时，细胞所产生的TNF-α本底浓度很低，随LPS浓度升高，TNF-α浓度显著升高；当LPS浓度高于10 ng/mL时，掺入AHA的细胞经LPS刺激后所产生的TNF-α浓度有所下降。综合以上结果，确定最优的实验条件为： 在含有1%胎牛血清DMEM（-）培养基中，分别在不加LPS和加10 ng/mL的LPS条件下刺激Raw264.7细胞4 h，在刺激细胞的同时掺入AHA。

3.2 在LPS刺激下Raw264.7细胞新生成蛋白质的检测

在24孔板里对所选取的4组样品进行细胞裂解，将所得的细胞裂解液转移至新的1.5 mL离心管中，离心后收集上清液，吸取600 μL进行点击化学反应，使新生成的蛋白质被标记上生物素。

将样品用0.05 mol/L碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）稀释到合适浓度后，4℃孵育过夜。利用生物素与亲和素之间的相互作用，使SA-HRP对新生成蛋白质上连接的Biotin进行识别，从而间接地指示新生成蛋白质的浓度（以Biotin浓度表示，图2A）。同时，用Western blot法对所得结果进行验证（图2B）。掺入AHA的两组样品，测得的Biotin浓度明显高于掺入Met的两组样品测得的Biotin浓度。Western blot结果表明，掺入AHA的两组样品通过HRP检测的结果为阳性，而掺入Met的两组样品的结果为阴性， 说明细胞中成功地掺入了AHA，且新生成蛋白质上成功地標记上了Biotin。然而，天然氨基酸Met分子由于没有叠氮基团，无法与Biotin-alkyne发生点击化学反应，因此新生成蛋白质无法标记上生物素。由图2可见，在掺入AHA的两组样品中，4号样品中的Biotin标记蛋白信号高于3号样品，说明细胞在LPS刺激下有更多的AHA分子被掺入到蛋白质中，产生了更多的新生成蛋白。

3.3 Raw264.7细胞在LPS刺激下新生成TNF-α蛋白的检测

利用抗体-抗原反应的特异性，用抗TNF-α抗体特异性捕获细胞裂解液中的TNF-α，再用SA-HRP对TNF-α上连接的Biotin进行识别，从而间接地反映新生成TNF-α的浓度（以Biotin浓度表示，图3B）；同时，以系列梯度稀释的Biotin-HRP为标准品，利用SA-HRP测定各孔在450 nm的吸光度，以Biotin的浓度对吸光度作图，绘制标准曲线（图3A）。根据标准曲线计算，分别得出4组样品中TNF-α的相对含量，发现LPS浓度为10 ng/mL时刺激细胞4 h后新生成的TNF-α的相对量为28.37 pmol/L。当LPS掺入浓度为0时，测得的新生成TNF-α浓度为12.11 pmol/L，高于掺入Met的两组，可能是因为AHA掺入时间较长，刺激细胞产生了额外的TNF-α。

4 结 论

以LPS刺激Raw264.7细胞产生TNF-α为体系，通过代谢掺入AHA ，并利用点击化学反应，使细胞中新生成的蛋白质标记上生物素标签。再利用吸附在固相载体上的抗体将TNF-α分子特异性捕获，达到对特定的新生成蛋白质（TNF-α）进行检测的目的。本研究为检测特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白质的周转等方面提供了可借鉴的方法。

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