RIP1和RIP3在心血管疾病中的研究进展

马丽娟，安永强，刘巍

细胞凋亡在多细胞真核生物的正常发育过程中扮演着重要角色，并参与机体内稳态的维持。细胞凋亡和死亡可由两种截然不同的途径引起，将细胞死亡具体为凋亡、坏死、自噬和有丝分裂灾难等，并提出程序性坏死（necroptosis）的概念，现已成为研究热点。

1 程序性坏死与凋亡的区别和联系

程序性坏死区别于凋亡，是一种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）非依赖性的程序性细胞死亡方式，其特点是：①质膜完整性严重破坏；②细胞及其内容物崩解；③细胞内容物释放后引起显著的炎症反应；④未形成凋亡小体。近年研究表明，细胞坏死同样存在可调控的信号通路，在程序性坏死中受体相互作用蛋白（RIP）是一类重要的调节细胞死亡或存活的信号分子，尤其是受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）与受体相互作用蛋白激酶3（RIP3）在程序性坏死信号通路中发挥关键性调控作用，其表达水平可提示程序性坏死程度[1]。

有报道称，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理后的L929细胞发生了细胞凋亡[2]。进一步研究发现，用TNF-α处理小鼠纤维肉瘤L929细胞后，同时出现凋亡和坏死；使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（Z-VAD）抑制细胞凋亡后，凋亡抑制的同时，出现细胞坏死。相比之下，以Z-VAD抑制细胞凋亡，反而加速坏死。表明某些类型的细胞坏死与凋亡存在共用部分信号转导通路，且坏死和凋亡的信号通路中一条通路受到抑制可影响另一通路[3]。

2 程序性坏死中重要调控分子：RIP家族

RIP家族是一种特异的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白，其在结构上都具有一段保守的激酶结构域，具有同源的N末端却有不同的募集域。因此，该蛋白家族成员有共同生物学功能, 在细胞受到外界环境影响时（如：病原体感染、炎症反应），可被上游信号激活，引发一系列下游的级联反应。激活转录因子而有些成员被激活后则协助死亡信号的转导，促进细胞死亡。RIP家族具有多个成员RIP1-7，虽然每个成员都有各自的功能，但目前RIP1和RIP3[4]起到关键的调控作用。

2.1 程序性坏死阻断剂Necrostatin-1类似物程序性坏死抑制剂Nec-1有三种类似物：RIPK1的活性抑制剂Nec-1，无活性Nec-1变体（Nec-1i）和更稳定的Nec-1变体（Nec-1s）。是一类合成的RIP1特异性阻断剂，是通过阻断RIP1和RIP3发生磷酸化，进而阻止细胞程序性坏死的发生。在体内，Nec-1和Nec-1i不仅是RIPK1抑制剂，而且是强效的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）抑制剂。在动物疾病模型中，考虑到涉及RIPK1 / RIPK3依赖性坏死的病理条件越来越多，Nec-1已被广泛应用于RIPK1参与的细胞坏死和炎症的研究中，高剂量Nec-1能够有效避免TNF诱导的程序性坏死。然而，在体内使用Nec-1逐渐出现一些问题：较低剂量Nec-1和Nec-1i表现致敏和产生细胞毒性作用。这种敏化不是因为RIPK1靶向阻断和程序性坏死，而是阻断靶向目标IDO的结果。Nec-1s不会干扰IDO，其无论是高剂量还是低剂量均具有细胞保护作用，无细胞毒性。因此，Nec-1s不仅是一种更具特异性的抑制剂，而且也是一种优异的抑制剂，更适用于体内应用[5]。

2.2 RIP1和RIP3在信号通路中的作用RIP1既参与程序性坏死，又参与细胞凋亡。当受到TNF刺激时，通过死亡结构域（DD）募集衔接蛋白TNF相关死亡结构域（TRADD）、TNF受体相关蛋白2（TRAF2）、RIP1、细胞凋亡抑制蛋白（cIAP）及线性泛素链组合体复合物（LUBAC），形成复合体1[6]。在RIPK1上的泛素链作为一个支架来激活NF-κB和有丝分裂蛋白激酶途径，并抑制坏死部分的形成，且cIAP介导的RIP1上的赖氨酸63（Lys63型）多聚泛素链修饰水平上调，从而下调RIP1与Caspase8、FADD形成复合物水平，抑制caspase级联引起的细胞凋亡，激活IKK/NF-κB通路，从而抑制凋亡[7]。

不同于TNFR1诱导的信号通路，凋亡通路启动后Fas诱导的信号直接募集FADD、RIP3和前体caspase 8，形成死亡诱导信号复合体，即复合体2[6,8]。复合体1和复合体2通过磷酸化的RIP1和RIP3的RHIM形成坏死复合物。坏死复合体形成后，自磷酸化的RIP3可募集混合系蛋白激酶结构域样蛋白（MLKL），磷酸化的MLKL形成低聚物，转移到胞内膜和质膜，导致膜破裂，执行程序性坏死[9-11]。通过抑制RIPK1/RIPK3/MLKL复合物的形成，LUBAC促进肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导NF-κB的激活，抑制TRAIL诱导的坏死[12]。

此外，Obitsu等[7]还发现桐油酸（ESA）所诱发的一种新的RIP1依赖的非典型的细胞凋亡是通过MEK/ERK途径来调节的。ESA激活的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，如钙调磷酸酶，其诱导RIP1脱磷酸化，激活ERK途径。ESA介导的细胞死亡与AIF和RIP1、AIF和ERK1/2的核转位及ROS产生有关。ROS的生成和ATP的减少会使线粒体结构破坏，导致细胞死亡。

2.3 RIP1和RIP3参与程序性坏死中的作用程序性坏死可通过不同机制执行，如：细胞能量代谢的加强、氧化损伤和炎症反应、可能参与一氧化氮（NO）介导的细胞坏死等作用机制。

2.3.1 参与细胞能量代谢作为一种新的程序性死亡方式，程序性坏死在许多疾病的病理过程中发挥了重要作用，特别是在急性炎症、缺血性损伤及病毒感染等急危重症中，由于caspase的活性有赖于一定水平的ATP，而此时细胞生成的ATP不足以支持caspase的功能，导致细胞出现程序性坏死。据报道[13]，过量的RIP3导致细胞能量代谢紊乱，过分加强糖原磷酸化酶谷氨酰胺合成酶（GLUL）及谷氨酸脱氢酶（GLUDl）的活性，且这些酶均为细胞能量代谢信号通路上的关键酶，通过加强细胞能量代谢，过量产生相关底物—磷酸化葡萄糖和酮戊二酸, 加强线粒体内三梭酸循环，引起活性氧物质ROS蓄积[7]，导致氧化应激反应增强。目前普遍认为，线粒体是细胞能量代谢的重要场所，参与多种细胞生命活动，决定细胞的存活或凋亡。线粒体功能障碍是导致细胞凋亡的一个重要机制，其中线粒体通透性转换（MPT）通路在该过程中发挥着重要作用，而活性氧的蓄积可使线粒体膜通透性改变，诱发细胞的程序性坏死。Northington等[14]发现Nec-1通过抑制DRP1蛋白的表达，减轻线粒体损伤和减少ROS的生成，进而减轻脑缺血缺氧损伤后细胞的坏死。

2.3.2 抑制氧化损伤和炎症反应通过影响细胞死亡、炎症和ECM降解，以细胞凋亡、原发性或继发（后凋亡）坏死为基础，导致炎症的释放，进而引发炎症。痘病毒serpin Spi/B13R 可抑制caspase-1和caspase-8，因此病毒感染早期产生的TNF可使不同组织、细胞出现程序性坏死。更重要的是感染后期，由于巨噬细胞发生程序性坏死，使大量结核杆菌被释放到胞外，从而加重感染。结核杆菌可通过诱导机体细胞发生程序性坏死，促进其自身的增殖与扩散[15]。RIP1抑制剂Nec-1s阻断细胞凋亡和坏死通路，间接抑制炎症反应[16]，Nec-1s也可通过阻止单核细胞的迁移和分化，直接抑制炎症反应[17]。

RIP1可作为一个死亡促进因子，在促进炎症细胞因子的生成方面具有重要作用[13]。在蛛网膜下腔出血后脑损伤的早期，NLRP3炎性体是炎症反应的一个重要组成部分。蛛网膜下腔出血（SAH）导致RIP1、RIP3、磷酸化蛋白和NLRP3炎性体表达上调，并通过RIP1-RIP3-DRP1信号通路进一步激活NLRP3炎性体[18]，增加细胞损伤。Northington等[14]发现Nec-1通过下调DRP1蛋白的表达，减轻线粒体损伤和减少ROS的生成，抑制NLRP3炎性体和减轻脑水肿和神经功能缺损等，抑制氧化损伤和炎症反应。采用Nec-1或RIPK3基因敲除的方法，避免肿瘤坏死因子诱导的致命性的全身炎症反应综合征（SIRS），表明抑制RIPK1/RIPK3信号通路可降低TNF引发的死亡率[19]。通过RIP1抑制necrostatin-1s（Nec-1s）避免了巨噬细胞因局部缺血引起的坏死，导致巨噬细胞浸润减少，抑制炎性免疫激活[20]。

2.3.3 NO介导的细胞坏死RIP1和RIP3介导的细胞程序性坏死是通过受体信号级联反应实现的。然而，RIP1和RIP3介导的非受体依赖型程序性坏死是通过NO发挥作用[21]。在缺血再灌注损伤后，心脏发生收缩功能障碍、代谢异常和结构改变，其中氧自由基的过量产生是导致心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的重要原因之一。组织缺血缺氧后体内产生大量的诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）[22]、NO和O2-，巨噬细胞、心肌细胞等催化iNOS迅速结合NO产生大量氧自由基，参与缺血性疾病、炎症和退行性神经病变等病理过程。在体大鼠心肌I/R损伤过程中，氧自由基大量生成，促进下游信号分子RIP1磷酸化，加重I/R损伤[23]。Nec-1s则通过降低iNOS水平，抑制NO大量生成，有效抑制NO介导的细胞坏死，对心肌具有保护作用。

2.3.4 抑制免疫反应和促进结缔组织修复心肌细胞外基质蛋白主要由弹性蛋白和胶原蛋白构成，胶原蛋白是ECM的主要组成成分，占ECM的80%，其中以Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白为主。弹性纤维是结缔组织的重要组成成分，使所在组织保持良好弹性。心肌梗死后,距离梗死时间越长，梗死区域Ⅰ型和Ⅲ型弹力纤维成分逐渐下降，而胶原纤维含量逐渐增多，弹性蛋白和胶原蛋白比例失调是梗死后瘢痕区硬度增加、弹性下降的病理学基础[24]。Nec-1s可上调LOX和弹性蛋白原表达，抑制胶原蛋白沉积，可改善弹性蛋白和胶原蛋白比例失调，促进结缔组织修复，使得心脏弹性收缩力增加，阻止心梗后心功能障碍[17]。

3 RIP1和RIP3与心血管疾病

3.1 RIP1和RIP3与冠心病在小鼠动脉粥样硬化模型中，RIP3基因敲除小鼠晚期粥样斑块的面积明显减小，且病灶中发生程序性坏死的巨噬细胞较野生型小鼠显著减少，但凋亡细胞数量无显著差异，提示RIP3依赖性坏死即程序性坏死与动脉粥样硬化晚期的发展密切相关[25]。Liu等[26]研究发现，大鼠心肌梗死后RIP1和RIP3 mRNA显著增加，而低剂量和高剂量组RIP1和RIP3 mRNA水平显著下降，高剂量组更为显著。进一步试验证明，梗死区内纤维组织的反应性增生明显，但实验组的梗死面积明显小于对照组。由此得出，Nec-1可明显抑制心肌缺血大鼠的心肌坏死，具有心肌保护作用[27]。受体相互作用蛋白3（RIP3）触发心肌坏死，除了炎症和细胞凋亡，是通过激活Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKII）而不是通过RIP1、RIP3和 MLKL。RIP3诱导激活CaMKII，通过磷酸化或氧化或两者引起线粒体通透性转换孔开放和心肌坏死[28]。

3.2 RIP1和RIP3与心肌再灌注损伤在转基因小鼠心脏中发现，RIP1/RIP3/MLKL信号通路及炎症反应被抑制，而此通路在pre-miR-223转基因的小鼠心脏缺血再灌注中被激活[29]。Nec-1抑制该通路用于治疗pre-miR-223转基因小鼠因缺血再灌注引起的心肌组织损伤，显著降低缺血再灌注触发的心肌坏死和功能障碍。总的来说，目前最主要的necroptosis是由TNF-α/TNFR1诱导的蛋白质复合体RIP1/3，此外还有CypD、NLRP3、RIP3及其RIP1、MLKL和CaMKII[28]。且确定了两个关键的细胞死亡受体TNFR1和DR6，其均为mir-223-5p直接目标，而mir-223-3p直接抑制NLRP3和IkappaB激酶α两个重要的媒介的表达，参与I/R诱导的炎症和细胞坏死。

3.3 RIP1和RIP3与病毒性心肌炎病毒感染对心肌组织的持续损害可能是病毒性心肌炎重要致病原因和机制，其主要表现为心肌细胞变性坏死、心肌纤维间和血管周围结缔组织中的炎性细胞浸润及间质纤维化引起的心肌重构等，最终导致左室扩张和心功能障碍。在柯萨奇病毒B3（CVB3）诱导的急性病毒性心肌炎中对心脏标本RIP1和RIP3坏死体进行检测，并在光镜及电镜下观察Nec-1对小鼠心肌损伤的保护作用，发现Nec-1组较CVB3组明显降低了RIP1和RIP3的阳性着色，Nec-1组小鼠心肌组织病变程度明显改善[30]。

4 总结和展望

RIP1和RIP3通过不同的作用机制，作用于各种疾病的发生和发展中。程序性坏死在炎症驱动和疾病病理学的基础上，逐渐被证实是治疗动脉粥样硬化、全身炎症反应综合征（SIRS）和缺血性损伤等疾病的治疗靶点。除上述作用机制外，尚有研究表明，NADPH氧化酶4（NOX4）和NOX4相关的氧化还原信号与心脏肥大有关。由此推测，通过RIP1和RIP3抑制剂可能延缓心肌纤维化进展，这可能是心肌纤维化治疗中的有益发现。