新鲜组织短时固定对冷冻切片质量的影响

方捷迪，王晓星，李争艳，张梦玲，周 琴，易慕华

冷冻切片是在低温环境下将术中取下的新鲜组织快速冷冻至一定硬度再制作切片，常用于临床病理快速诊断和部分形态学研究工作。用于临床的冷冻切片能够让外科医师在手术过程中尽快了解病变性质并及时决定手术方式[1-2]。精准的术中快速病理诊断结果，需高品质的冷冻切片作为保障。多种因素影响冷冻切片的效果，如冷冻时间与温度、取材、切片技术和染色等[3-4]，而冰晶的形成是影响病理诊断的重要因素之一。因此在冷冻切片中防水是必须注意事项：取材刀具、面板必须擦干，组织不能遇水固定，若组织湿润应取纱布擦拭。因受时间及制片技术的限制，快速诊断具有更多的局限性和误诊的可能，在工作中我们遇到1例，冷冻报告发出20 min后上级医师复检切片发现微小异型，怀疑取材不规范，此时组织固定已十多分钟，用蔗糖处理已不现实，只有迅速捞出组织重新取材，冷冻切片染色，镜下观察组织结构与新鲜组织切片无差异，打破了冷冻切片组织不能固定遇水的提法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料随机选取三峡大学仁和医院手术室送检的术中切除标本20例，每例标本均确保规范化操作。

1.2试剂OCT胶水购自Leica公司，苏木精、伊红、中性树胶均购自Baso公司，二甲苯、甲醛购自武汉市中天公司，无水乙醇购自广东汕头西陇公司。10%中性福尔马林配制：蒸馏水1 000 mL，甲醛溶液(37%)100 mL，磷酸二氢钠4 g，磷酸氢二钠6.5 g，用1N氢氧化钠调整pH7.2～7.4。

1.3仪器冷冻切片机(Leica CM1950，德国)。

1.4制片首检手术室大体新鲜活体组织并取材，根据组织类型选择最佳的冷冻温度直接速冻，实验中所有切片5 μm厚，切片立即放入95%乙醇中固定10～20 s[5]。采用Gill改良苏木精染液[6-7]，染色时间2～3 min，分化返蓝，伊红30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。医师镜检，病理报告发出后立即用10%中性福尔马林固定组织，分别固定10、20、30 min，取材、切片、染色等步骤同上。

2 结果

在取材部位、冷冻时间与温度、切片固定方法与时间、染色过程相对一致的前提下，组织处理最佳固定时间是以在镜下得到最佳的组织清晰度和最大强度核质比的冷冻切片为标准[7]。本实验选取的术中切除标本20例，快速冷冻切片所得出的实验结果一致。

术中切除标本即时冷冻切片与组织处理后的冷冻切片行HE染色，与新鲜组织冷冻切片对比后发现利用10%中性福尔马林固定液处理的组织仍适用于快速冷冻切片，因10%中性福尔马林为甲醛和水的混合溶液，推翻了以往做冷冻切片的组织不能遇水的说法。结果表明，随着处理时间的延长，冷冻切片质量有所下降，其中以处理时间10 min组织冷冻切片效果最理想，即组织离体后利用10%中性福尔马林对组织进行固定，固定时长10 min，固定液的量为组织总体积的5～10倍，冷冻切片组织结构清晰，细胞核和细胞质着色均匀且对比度佳，冰晶数量可控，镜下观察与新鲜组织冷冻切片相一致；而当处理时间为30 min组时，冷冻切片组织结构清晰度下降，组织间隙增宽，间质及细胞中出现冰晶，组织黏附性下降，染色冲洗易掉片，不能完全达到冷冻切片的诊断要求。经多次反复实验得出利用10%中性福尔马林处理10 min后的组织仍可用于快速冷冻切片，其完全能达到冷冻切片的质量要求(图1)。

3 讨论

现阶段冷冻切片技术的地位日益增加，在指导临床医师明确病变性质并制订合理的手术方案具有重要的意义。冷冻切片要求准确及时发放病理报告，避免出现漏诊和误诊现象，质控要求切片组织结构清晰，细胞核质分明且对比度好，其质控直接影响病理诊断的准确性和及时性，间接影响患者的治疗和预后情况[8]。

冷冻切片多用于术中急会诊，是病理医师实践中最重要、最困难而又压力最大的一项工作，它要求病理医师经验丰富，掌握临床医学知识，能在压力之下迅速作出决断，有良好的判断力，保持适度保守的态度，并且了解该方法的局限性[9]。受时间、标本、经验及制片技术的限制，快速诊断具有更多的局限性和误诊的可能性。因此，高年资医师复诊切片就显得尤为重要，对探讨组织固定后的制片质量也有益处。

ABCD

图1新鲜甲状腺切除标本与组织处理后的标本冷冻切片HE染色：A.新鲜标本；B.处理10 min；C.处理20 min；D.处理30 min

新鲜组织经甲醛短时固定后，不影响切片质量。甲醛固定组织是一个复杂的过程，包括渗透、结合、交联三位一体模式，10%中性福尔马林是国际上提倡使用的最佳组织标本固定剂，优点是渗透力强、穿透性好、固定均匀、组织收缩小、HE染色对比鲜明，且对大多数抗原及肿瘤基因的保存良好，一直被推崇为首选固定液。术中标本经10%中性福尔马林短时处理，甲醛渗入使蛋白质分子发生交联产生固定作用，妨碍水分大量渗入组织，间接减少冰晶形成，保证冷冻切片的质量。随着组织处理时间的增加(30 min)，标本含水量加大，冷冻时间延长，缓慢冷冻导致冰晶出现，且组织黏附性降低容易掉片，即使调低机厢温度，使用防脱玻片亦不能改善切片质量。因为缓慢冷冻使细胞内的水分子向细胞间质疏松区域游离、聚集，然后凝结成冰，冰晶会把组织或细胞间隙扩大，等切片快速放入固定液后，冰融化成水，周围组织收缩，引起组织结构变形并留下大量空洞，切片诊断困难，导致误、漏诊。

本实验选取的术中切除标本20例，所有冷冻切片所得出的实验结果一致：即利用10%中性福尔马林固定液处理10 min，固定液的量为组织总体积的5～10倍，且组织不经蔗糖等高渗溶液处理，冷冻切片组织结构仍然清晰，冰晶形成在可控范围内，细胞核和细胞质着色均匀且对比度佳，完全可以用于术中病理诊断，提示冰晶形成与速冻速度有关，与组织短时遇水关系有限。

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