乳腺浸润性导管癌中Axl蛋白的表达及意义

周 萍，王 莉，黄一凡，侯 俊，汤 梅，王 琼

Axl蛋白属于跨膜酪氨酸激酶受体蛋白，其基因最早在慢性粒细胞白血病患者体内发现，该受体包含1个胞内(C末端)激酶结构域和1个独特的胞外(N末端)结构域，前者包含3个自磷酸化位点(Tyr779、Tyr821、Tyr886)，后者由2个免疫球蛋白样结构域和2个重复纤维连接蛋白Ⅲ组成，类似于神经细胞黏附分子结构[1-2]。Axl蛋白的过表达能促进肿瘤形成和演进，包括肿瘤的浸润、转移、细胞存活、血管生成、对化疗和靶向治疗药物耐药、细胞转化及细胞增殖等均有促进作用[3-4]。已有文献报道[5]Axl蛋白在甲状腺、食管、胃、肺、肝脏、乳腺等多种肿瘤组织中高表达，并认为其是有效的靶向治疗基因位点[6]。本文通过检测乳腺浸润性导管癌中Axl蛋白的表达，进一步明确其与临床病理特征的相关性，为靶向治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料收集川北医学院附属医院病理科2012年1月～2013年6月存档的乳腺浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)石蜡样本151例，排除术前进行新辅助治疗的病例，从中筛选有完整临床资料和随访资料的70例IDC，由两位有经验的乳腺病理医师根据WHO(2012)乳腺肿瘤分类标准对所有纳入病例共同阅片，并进行组织学分级。70例患者中位年龄47.5岁，平均49.9岁(35～68岁)，其中左侧乳腺31例(44.3%)，右侧乳腺39例(55.7%)。48例(68.6%)患者伴同侧腋窝淋巴结转移，转移淋巴结数目1～31枚不等，1例患者伴骨转移，1例肺转移。Nottingham组织学分级：Ⅰ级5例(7.1%)，Ⅱ级41例(58.6%)，Ⅲ级24例(34.3%)。肿瘤临床分期：1期6例(8.6%)，2期39例(55.7%)，3期23例(32.9%)，4期2例(2.9%)。70例患者随访时间10～52个月，其中61例(87.1%)存活，9例死于该病(12.9%)。

1.2方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化EnVision两步法进行染色[7]，除Axl抗体购自Abclonal公司外，其余抗体及试剂均购自北京中杉金桥公司。Axl为兔多克隆抗体，ER、PR、HER-2、Ki-67为兔单克隆抗体，CK5/6为鼠单克隆抗体。定位于细胞膜和细胞质的抗体，采用枸橼酸水浴修复组织；定位于细胞核的抗体，采用EDTA水浴修复组织。Axl抗体以试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照；ER、PR、CK5/6以乳腺内正常乳腺组织为阳性对照；HER-2以IDC中的3+病例作阳性对照；Ki-67以淋巴结生发中心为阳性对照；所有病例均以PBS代替一抗作为空白对照。

1.2.2荧光原位杂交 所有免疫组化染色评估为HER-2(2+)的病例，均进行荧光原位杂交检测。HER-2双色荧光探针购自广州安必平公司。石蜡组织4 μm厚切片，依次经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，灭菌纯水洗涤后煮沸20 min，胃蛋白酶消化5～15 min后梯度乙醇脱水，杂交仪中85 ℃变性5 min，37 ℃杂交10～18 h，杂交完成后洗涤，DAPI复染细胞核，封固观察。以组织中≥75%的细胞核显示双色信号时视为杂交成功。

1.3结果判定HER-2蛋白表达结果由两位有经验的乳腺病理医师，根据2013年美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会(ASCO/CAP)推荐的HER-2检测指南标准进行判读[8]：肿瘤细胞无包膜着色或≤10%的肿瘤细胞膜不完整的微弱阳性为0；>10%的肿瘤细胞膜不完整的微弱阳性为1+；>10%的肿瘤细胞膜不完整的弱到中等强度阳性或≤10%的肿瘤细胞膜完整的强阳性为2+；>10%的肿瘤细胞膜完整的强阳性为3+。荧光原位杂交检测结果由具有分子检测资质的病理医师根据2013年ASCO/CAP推荐的HER-2检测指南标准进行判读[8]，连续计数40个浸润癌细胞，HER-2/CEP17比值≥2.0，或HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷贝数/细胞≥6.0均为HER-2阳性；HER-2/CEP17比值<2.0，且平均HER-2拷贝数/细胞<4.0为HER-2阴性；HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷贝数/细胞≥4.0，但<6.0为HER-2原位杂交不确定。Axl蛋白阳性定位于细胞膜，根据肿瘤细胞膜着色强度计分：无着色为0分，弱着色为1分，中等强度为2分，强着色为3分；根据肿瘤阳性细胞所占比例计分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分；将着色强度与阳性百分比评分相加得到肿瘤细胞阳性评分，≥4分即为高表达[9]。ER、PR、Ki-67蛋白以细胞核棕褐色着色为阳性，根据Allred评分标准[10]对染色结果进行判读：Allred评分总分为百分比评分与强度评分总和，总分≤2分为阴性，≥3分为阳性。按阳性百分比评分：无阳性细胞为0分，<1/100为1分，>1/100且<1/10为2分，≥1/10且<1/3为3分，≥1/3且<2/3为4分，≥2/3为5分；按阳性强度评分：无着色为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分， 强阳性为3分。肿瘤分子分型采用2015年St.Gallen国际专家共识推荐的乳腺癌分子分型标准进行分类[11]。

1.4统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，以P<0.05为具有统计学意义。Axl蛋白在不同分子亚型组、不同组织学级别及不同临床分期的表达差异采用方差分析，Axl蛋白与临床病理特征的相关性采用Spearman等级相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier检验法。

2 结果

2.1肿瘤分子分型70例乳腺IDC免疫组化标记显示：51例(72.9%)ER(+)，40例(57.1%)PR(+)，4例(5.8%)CK5/6(+)，19例(27.1%)HER-2(+)，其中11例(15.7%)为HER-2(3+)，8例为HER-2(2+)，经荧光原位杂交证实为扩增病例。根据2015年St.Gallen国际专家共识推荐的乳腺癌分子分型标准[12]，管腔A型8例(11.4%)；管腔B型，HER-2(-)37例(52.9%)；管腔B型，HER-2(+)7例(10.0%)；HER-2亚型12例(17.1%)；三阴型6例(8.6%)，其中基底亚型4例(5.8%)。

2.2Axl蛋白表达与乳腺IDC临床病理特征的关系70例患者的肿瘤细胞膜均不同程度表达Axl蛋白，其中29例(41.4%)为高表达(≥4分)，41例(58.6%)呈低至中等表达(<4分)，且在浸润癌中的表达高于浸润灶旁的导管内癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)，高级别浸润癌中的表达高于低级别浸润癌(图1)。Axl蛋白表达在不同组织学级别(P<0.001)和不同分期(P=0.005)均有统计学意义，在不同分子分型间的表达差异无统计学意义(P=0.273)。采用相关性分析进一步提示Axl蛋白的表达与肿瘤级别(rs=0.651、P<0.001)、有无淋巴结转移(rs=0.474、P<0.001)以及转移数目(rs=0.550、P<0.001)、肿瘤分期(rs=0.355、P=0.003)、Ki-67增殖指数(rs=0.402、P=0.001)均呈正相关，与患者年龄(P=0.457)、肿瘤大小(P=0.682)、ER(P=0.416)、PR(P=0.574)、HER-2(P=0.150)状态及肿瘤的分子分型(P=0.344)均无相关性。

2.3生存分析70例患者中高表达Axl蛋白的患者总生存率(79.3%)低于中～低表达组患者(92.7%)(χ2=3.877，P=0.049，图2A)，淋巴结转移数目<4的患者总生存率显著优于转移数目≥4的患者(χ2=4.783，P=0.029，图2B)，但在淋巴结有无转移两组间，总生存率差异无统计学意义(χ2=0.001，P=0.980)。不同组织学级别与不同临床分期患者的总生存率，在本组中差异无统计学意义(χ2=0.058，P=0.809；χ2=2.425，P=0.119，图2C、D)。

3 讨论

酪氨酸激酶家族蛋白是一组跨膜蛋白，由受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)和非受体酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinases, NRTKs)组成，RTKs被认为参与肿瘤形成，可作为肿瘤治疗的靶点[12]。RTKs中存在受体激酶TAM(包括Tyro-3、Axl、Mer)，其中Axl最初分离自慢性粒细胞白血病细胞染色体19q13.2和20外显子[13]，目前已在多种肿瘤组织中发现Axl蛋白过表达。本组乳腺IDC肿瘤细胞的细胞膜均有不同程度Axl蛋白表达，其表达在浸润性癌高于周边DCIS，在高级别浸润性癌中表达高于低级别浸润性癌，在不同组织学级别的表达具有差异性，且与肿瘤级别呈正相关，提示Axl蛋白的活化具有调节肿瘤细胞分化、促进肿瘤向高级别演进的作用，但其分子机制和演进过程尚不完全清楚。文献报道Axl与多个信号通路相关，其中PI3K/Akt通路是其主要的细胞内信号通路[2]。Axl是TGF-β1下游的效应器，可通过TGF-β1介导其表达对乳腺癌细胞进行调节，从而增强肿瘤细胞的浸润能力，降低细胞对化疗的敏感性，该调节作用部分依赖于PI3K/Akt-PAK1信号通路[6]。

图1A.Axl蛋白在DCIS中的表达，EnVision两步法；B.Axl蛋白在低级别IDC中的表达，EnVision两步法；C. Axl蛋白在高级别IDC的表达，EnVision两步法；D.Axl蛋白在淋巴结转移灶中的表达，EnVision两步法

既往体外实验研究还发现上调Axl蛋白的表达，能促进前列腺癌细胞的迁徙[14-15]和胰腺癌的远处转移[16]。本组伴淋巴结转移的患者Axl蛋白表达高于无转移者，且其表达与转移数目、临床分期和Ki-67增殖指数呈正相关，进一步提示Axl蛋白的高表达是肿瘤转移、演进和增殖的重要促进因素。文献报道Axl蛋白的表达上调与乳腺癌患者肿瘤分化、淋巴结转移及临床分期密切相关，认为Axl作为生长因子，在促进肿瘤浸润和转移中起重要作用[6,12]，与本实验结果一致。Axl蛋白表达的上调可能与PI3K/Akt-PAK1信号分子的蛋白磷酸化水平有关，但其具体机制尚待进一步分析[6]。

图270例浸润性乳腺癌患者不同Axl表达状态(A)、淋巴结转移状态(B)以及不同组织学分级(C)和不同临床分期(D)的Kaplan-Meier生存曲线

本组患者年龄、肿瘤大小、ER、PR及肿瘤分子分型与Axl蛋白的表达无相关性，文献报道ER能促进Axl的表达，两者的相互作用在乳腺上皮细胞增殖、分化和凋亡过程中起重要作用[17]，同时PRB能使Axl的配体Gas6表达上调20倍。另有研究认为HER-2可活化Axl，具有重要的临床意义，但在本组中未发现ER、PR表达以及HER-2状态与Axl具有明确相关性，由于本组有完整随访资料的病例有限，有待进一步扩大样本深入分析。

本组生存分析显示，Axl蛋白的高表达预示患者总生存率下降，是预后的不良因素，Dunne等[18]在早期结肠癌患者中发现Axl水平的上调提示临床预后差，与本组结果一致。淋巴结转移对肿瘤患者预后具有提示作用，本组发现当淋巴结转移数目<4时，患者总生存率与无淋巴结转移者差异无显著性，但当转移数目≥4时，患者的总生存率显著下降，提示淋巴结转移状态对乳腺IDC患者预后的影响并不直接取决于是否有淋巴结转移，而是主要取决于转移数目，转移数目≥4提示患者预后不佳。

Axl蛋白作为跨膜酪氨酸激酶受体蛋白，在乳腺IDC中其高表达提示具有促进肿瘤演进的作用，包括向高级别肿瘤分化、增殖、浸润、转移等，提示患者预后不佳，对患者预后评估具有一定指导作用。目前，本实验在蛋白水平对Axl进行初探，在后续工作中将扩大样本量，并从分子水平进一步分析Axl及其配体在乳腺癌中的作用机制和对临床治疗的指导意义。

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