卵巢癌中gC1qR的表达及其凋亡机制

王 伟，纪 捷，程 雪，张静敏，郭凌川

卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率位居第3位，病死率位居首位，近年其发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，卵巢肿瘤细胞减灭术加辅助化疗是晚期卵巢癌的规范性治疗方案，但治疗过程中易出现卵巢癌细胞的原发性和获得性多药耐药现象。球状C1q受体(gC1qR)属于线粒体膜蛋白，具有多重生物学功能，在机体抗感染、炎症、细胞增殖、凋亡等生物学过程中发挥重要作用[2]。本文着重探讨gC1qR基因在卵巢癌中的表达及其生物学意义，为临床和病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1材料收集2013年6月～2016年5月南京医科大学附属妇产医院诊治的48例卵巢癌患者，经病理学确诊，临床资料完整。患者年龄33～67岁，平均(52.1±14.2)岁；浆液性囊腺癌35例，黏液性囊腺癌12例，子宫内膜样癌1例。另收集癌旁组织48例无癌细胞浸润作为对照。所有标本取材后均置于-79 ℃保存。

1.2试剂及仪器MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；T4DNA连接酶、各种限制性内切酶由Invitrogen公司提供；Trizol、Taq DNA酶、RNA酶抑制剂、逆转录酶M-MLV、Oligo(dT)15及dNTPs购自美国Sigma公司；gC1qR和β-actin基因引物由上海博亚公司合成。Prime 7300荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3卵巢癌细胞培养卵巢癌细胞株SKOV3由杭州赫贝公司提供。卵巢癌细胞株SKOV3接种于含有10%小牛血清的DMEM完全培养液中，置于37 ℃ 5%CO2饱和湿度培养箱内培养，显微镜下观察，待细胞贴壁生长，3天后换液，除去非贴壁细胞。当卵巢癌细胞布满瓶底时，可继续传代。

1.4RT-PCR检测取100 mg肿瘤组织研磨成粉末后加入定量Trizol。按常规提取总RNA，以β-actin为内参照进行gC1qR的定量检测，gC1qR引物与探针的设计是根据GenBank上gC1qR cDNA序列，其上游序列：5′-AATCACACGGTAGACACTGAAATGCC-3′，下游序列为：5′-CATCATCCCATCTAAAATGTCCCCTG-3′，探针序列：5′-TGCTCCAGTTCAACCAACGTCCTTCTC-3′。β-actin引物上游序列：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3′，下游序列：5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATA-3′，探针序列：5′-ACGCGCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3′。PCR反应体系在ABI Prime 7300定量PCR检测仪，参数设为50 ℃ 2 min、95 ℃ 5 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 2 min，33个循环，单点荧光在60 ℃进行检测。选择FAM荧光检测模式，对于实验数据，以下公式进行计算：2-ΔΔCT=2-(CT.gC1qR-CT.actin)Time x+(CT.gC1qR-CT.actin)Time 0。

1.5gC1qR质粒转染与分组将培养的卵巢癌细胞分为3组，分别为pcDNA3.1-gC1qR载体、pcDNA3.1空载体及不经任何处理的空白组。转染前将0.8 μg质粒DNA稀释在50 μL Opti-MEM液体中，充分混匀，室温放置5 min；将2.0 μL Lipofectamine稀释在50 μL Opti-MEM液体中，充分混匀，室温放置10 min。将上述两种液体混合，室温放置30 min，将混合液分别加入卵巢癌细胞培养瓶中，37 ℃ 5%CO2孵箱培养6～8 h，换液，加入完全培养液继续培养24 h，以pcDNA3.1载体中的绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断质粒的转染效率，确定最佳收获卵巢癌细胞的时间。

1.6Westernblot法检测取卵巢癌组织剪碎加入细胞裂解液均匀裂解，以1 500 r/min离心5 min，取上清液定量，备用。每个标本取100 μg总蛋白上样置于SDS-PAGE胶的样孔内，进行电泳。目的蛋白被适当分离后，将转膜后的PVDF膜放入含5%的脱脂奶粉TBS中封闭2 h；加入5%脱脂奶粉稀释一抗，摇床上37 ℃孵育4 h，以TBS洗3次，每次15 min，加入HRP结合的二抗(购自Cell Signaling公司)，37 ℃孵育1 h。TBST洗涤后，化学发光、显影、定影。以Bio-Rad凝胶成像分析仪，对印迹条带进行灰度扫描，采用以下公式计算：目的蛋白/内参蛋白。

1.7免疫组化染色所有组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，免疫组化采用SP法染色。微波抗原修复后，依次加入3%过氧化氢和正常非免疫动物血清封闭，温育15 min；滴加一抗50 μL，4 ℃过夜；PBS冲洗，加二抗(购自美国Santa Cruz公司)37 ℃，1 h，DAB显色并适时终止，苏木精复染2 min，盐酸甲醇分化后脱水，透明，中性树胶封固，镜下观察。免疫组化结果判断以细胞质内有棕褐色颗粒为阳性。

1.8卵巢癌细胞线粒体功能检测

1.8.1卵巢癌细胞内活性氧(ROS)的测定 将卵巢癌细胞接种至6孔培养板，实验如上述分组，卵巢癌细胞培养至指定时间，加入终浓度为10 μmol/L H2DCFDA孵育20 min，经37 ℃ 5%CO2培养箱中静置0.5 h，以PBS洗涤细胞3次；倒置荧光显微镜检测细胞内ROS产生(激发光488 nm、发射光530 nm)，以对照组的荧光强度作为细胞内ROS水平。

1.8.2卵巢癌细胞内线粒体膜电位的测定 将卵巢癌细胞接种至6孔培养板，实验如上述分组，卵巢癌细胞培养至指定时间，加入终浓度为10 μmol/L的JC-1，37 ℃ 20 min；荧光显微镜下检测JC-1单体时的变化(激发波长485 nm、发射波长530 nm)，以对照组的荧光强度作为细胞内线粒体膜电位。

1.8.3卵巢癌细胞线粒体内Ca2+测定 将卵巢癌细胞消化，PBS液重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清；用PBS重悬细胞1～2 mL，加入Fluo-3/AM-DMSO，调整终浓度为5 μmol/L，混匀，37 ℃避光孵育45 min；1 000 r/min 离心5 min，弃上清，PBS调整细胞浓度为每毫升1×106个细胞，流式细胞仪检测。

1.9卵巢癌细胞增殖活性的测定MTT比色法：用含10%胎牛血清配成单个细胞悬液，接种至96孔板；5%CO2、37 ℃培养48 h，每孔加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h，终止培养，弃上清。每孔加DMSO 150 μL，震荡10 min，采用OD 490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制卵巢癌细胞生长曲线。

1.10卵巢癌细胞迁移的测定采用Transwell实验，实验前将卵巢癌细胞饥饿24 h，用含BSA的无血清培养基调整细胞密度为每毫升5×105个细胞。取卵巢癌细胞悬液100 μL置于Transwell小室，小室下室加入600 μL含20%FBS培养基，培养24 h，以0.1%结晶紫染色20 min，通过细胞染色，显微镜下直接计数“贴壁”细胞，计算卵巢癌细胞的迁移能力。

1.11卵巢癌细胞凋亡检测取对数生长期的卵巢癌细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清。PBS充分洗涤细胞2次，用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞。取100 μL的细胞悬液重悬细胞，加入5μL Annexin FITC和10 μL的PI溶液，室温避光孵育30 min。加入400 μL结合缓冲液，1 h内流式细胞仪分析检测。采用激发光488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。

2 结果

2.1卵巢癌组织中gC1qR的表达PCR检测结果显示，42例(87.5%)卵巢癌组织中gC1qR mRNA表达水平下调，癌旁组织中3例(6.25%)gC1qR mRNA表达水平下调(P<0.001)；同期以Western blot法检测gC1qR蛋白表达，结果显示44例(91.7%)卵巢癌组织中蛋白表达水平下调，而癌旁组织中仅5例(10.4%)蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.001，图1)；采用免疫组化SP法检测gC1qR蛋白，其主要表达于细胞质中；gC1qR基因在卵巢癌组织中的表达明显低于其相应的癌旁组织，两者差异具有显著性(P<0.05)。

图1 gC1qR 蛋白表达

2.2卵巢癌细胞株SKOV3的形态与质粒转染

2.2.1光学显微镜形态 卵巢癌细胞形态为多角形或短梭形，胞核居中呈圆形或椭圆形，核仁多为2～3个。质粒转染培养至48 h，pcDNA3.1-gC1qR质粒转染组，卵巢癌细胞形态变小、变圆，胞质回缩，细胞间隙显著增大，细胞核变小、变圆，细胞质相对较大，核质比例变小，核仁数量显著减少，随着转染时间的延长，贴壁生长的细胞数量明显减少，溶解与死亡的细胞数目显著较多，伴随出现大量细胞溶解碎片。空载体组与PBS组，细胞排列密集，间隙小，细胞形态正常，核质比大，核仁多见，两者形态无明显差异。

2.2.2透射电镜形态 质粒转染48 h后，观察pcDNA3.1空载体组显示，细胞核质比较大，核仁多为2～3个，且体积较大，细胞表面有大量微绒毛，与PBS组比较，细胞形态基本正常，无显著改变。观察pcDNA3.1-gC1qR质粒组显示，细胞形态出现显著改变：细胞表面微绒毛明显减少，细胞质体积相对增大，出现大量空泡，部分细胞器变性，形成凋亡小体，细胞核边缘化，核凝缩并发生断裂，细胞核内染色质增多且边缘化(图2)。

2.2.3细胞免疫荧光 将培养的SKOV3细胞分别转染pcDNA3.1-gC1qR质粒和pcDNA3.1空载体，绿色荧光为系统指示标记荧光，蓝色荧光为gC1qR蛋白表达，48 h后荧光显微镜观察显示，与PBS组比较，pcDNA3.1-gC1qR质粒组，蓝色荧光表达量显著增多，且主要富集于细胞质中；而与pcDNA3.1-gC1qR质粒组比较，pcDNA3.1空载体组，蓝色荧光表达量显著减少(图3)。

2.2.4gC1qR蛋白的表达 实验结果表明，pcDNA3.1-gC1qR质粒组蛋白表达水平显著升高，其升高分别为pcDNA3.1空载体组与PBS组的5.06倍(P<0.001)和3.34倍(P<0.001)；pcDNA3.1空载体组与PBS组之间，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3卵巢癌细胞SKOV3的生物学功能检测

2.3.1gC1qR基因对SKOV3细胞增殖及凋亡的影响 MTT法实验结果表明，与PBS组比较，转染pcDNA3.1-gC1qR质粒48 h，SKOV3细胞增殖率呈显著下降，两组差异有统计学意义(P<0.01)，而pcDNA3.1空载体组与PBS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

Transwell实验数据表明，转染pcDNA3.1-gC1qR质粒48 h后，发生迁移的SKOV3细胞数量仅为PBS组的47.3%，两组比较差异有显著性(P<0.01)，而pcDNA3.1空载体作用于卵巢癌细胞，实验结果显示与PBS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

②A②B②C③A③B③C

图2SKOV3细胞超微结构：A.pcDNA3.1-gC1qR质粒；B.pcDNA3.1空载体；C.PBS组图3SKOV3细胞荧光定位：A.pcDNA3.1-gC1qR质粒；B.pcDNA3.1空载体；C.PBS组

流式细胞技术检测所得数据表明，与PBS组比较，pcDNA3.1-gC1qR质粒组卵巢癌细胞凋亡数量显著增多，差异有统计学意义(P<0.001)；与PBS组相比，pcDNA3.1空载体组卵巢癌细胞凋亡数量未见明显增多，差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

图4 SKOV3细胞凋亡检测

2.3.2gC1qR基因对SKOV3细胞线粒体功能的影响 转染48 h后，透射电镜观察卵巢癌细胞线粒体形态的改变。pcDNA3.1空载体组与PBS组电镜下可见卵巢癌细胞线粒体形态基本正常，无显著改变，线粒体嵴清晰可见；gC1qR基因质粒转染组电镜下可见线粒体形态发生显著改变，线粒体嵴断裂、消失、基质呈疏松状态，部分线粒体明显肿胀，围绕在细胞核周围呈密集排列，小部分线粒体甚至呈空泡状(图5)。

本实验检测线粒体的功能指标：PCR对线粒体拷贝数进行检测，结果发现与PBS组相比，gC1qR基因过表达可显著减少线粒体拷贝数，两组相比差异有统计学意义(P<0.01)；pcDNA3.1空载体组卵巢癌线粒体拷贝数与PBS组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。Fluo-3/AM荧光检测细胞线粒体内Ca2+浓度，与PBS组相比gC1qR基因过表达，卵巢癌细胞线粒体内Ca2+负荷显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)；空载体质粒组与PBS比较，Ca2+浓度差异无显著性(P>0.05)。

应用H2DCFDA、JC-1荧光探针，观察细胞内的ROS含量及线粒体膜电位改变。所得实验数据表明，与PBS对照组比较，转染质粒组gC1qR基因过表达能显著诱导SKOV3细胞ROS的产生(P<0.001，图6)；同时，gC1qR基因过表达能显著降低SKOV3线粒体膜电位，与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。pcDNA3.1空载体质粒组，ROS的产生、线粒体膜电位与PBS组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

细胞凋亡、增殖是多细胞生物体保持细胞数量作为锚定在线粒体膜表面的gC1qR蛋白，具有多向性调节作用，如参与了细胞周期的进程、细胞的增殖、蛋白质的加工翻译以及细胞衰老与凋亡等生理功能[4-5]。研究发现，作为补体C1q受体，在外源性化学毒物作用下，gC1qR可介导单核细胞的凋亡，影响单核细胞的生物学功能[6]。文献报道，gC1qR基因可诱导p53表达，致使子宫颈癌细胞凋亡[7-8]。本组实验数据显示，pcDNA3.1-gC1qR载体转染卵巢癌细胞48 h，SKOV3细胞增殖、迁移率明显降低，而细胞的凋亡率显著增加，且细胞呈显著的凋亡特征；同期透射电镜下观察卵巢癌细胞形态有显著改变：细胞表面微绒毛明显减少，细胞质体积相对增大，出现大量空泡，部分细胞器变性，形成凋亡小体，细胞核边缘化，核凝缩并发生断裂，细胞核内染色质增多且边缘化；以上结果提示：gC1qR基因过表达对卵巢癌细胞的凋亡有促进作用。

ABC

图5SKOV3细胞线粒体形态：A.pcDNA3.1-gC1qR质粒组；B.pcDNA3.1空载体组；C.PBS组

图6 SKOV3细胞线粒体ROS总量

动态平衡的重要生理过程[3]，因细胞凋亡有别于病理条件下细胞坏死，研究者积极探索细胞凋亡的本质，以期发现细胞凋亡在多种疾病中的重要作用，实现治疗、预防疾病的临床意义。

线粒体作为引发细胞内源性凋亡途径的主要执行细胞器，应激因素作用下，线粒体膜通透性增高，释放的Cyt C与Apaf-1结合，激活Caspase家族引发细胞最终凋亡程序[9]。已知线粒体可以通过以下途径实现细胞凋亡：(1)释放相关的凋亡因子引发细胞凋亡；(2)损坏电子传递链，扰乱氧化磷酸化过程，抑制ATP的产生；(3)破坏细胞的抗氧化能力[10-11]。当外源性物质刺激细胞时，线粒体作为ROS产生的重要场所，ROS产生量明显增多[12]。高水平的ROS致使线粒体损伤，进而引发线粒体膜电位的改变，释放p21、Bax及Caspase 3等各种促凋亡因子诱导细胞，引发凋亡[13]。gC1qR作为锚定在线粒体上的膜蛋白，其过表达可显著诱导卵巢癌上皮细胞的凋亡，同时gC1qR还能有效诱导卵巢癌细胞线粒体功能的改变。首先，实验结果发现gC1qR质粒转染卵巢癌细胞，其线粒体拷贝数显著减少；且线粒体嵴断裂、消失、基质呈疏松状态，部分线粒体明显肿胀，围绕在细胞核周围呈密集排列，小部分线粒体甚至呈空泡状；其次，gC1qR基因过表达，卵巢癌细胞线粒体内Ca2+负荷显著增多；最后，gC1qR基因可显著诱导卵巢癌细胞ROS的产生、降低线粒体膜电位，本实验结果与文献报道高度一致。

综上所述，本组结果表明，gC1qR基因在卵巢癌细胞凋亡中发挥重要作用，在该过程中gC1qR基因可通过引发线粒体功能障碍，诱导卵巢癌细胞凋亡。

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