术中冷冻病理与石蜡包埋组织中B-raf基因V600E突变检测的对比分析

郑细闰，刘 影，张志发，李楚天，何青莲，郑广娟

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)在甲状腺癌中发生率最高，约占85%[1]。PTC术后10年生存率可达90%以上，其预后虽良好，但尚有少部分PTC患者因肿瘤具有较强的侵袭性而不易完整切除，从而导致病情迁延或疾病复发[2]，因此预后判断与合理的干预措施对PTC的治疗有重要意义。研究表明，B-raf基因V600E突变与PTC的临床病理特征相关[3]，且近年针对B-raf基因V600E突变的分子靶向药物(如Vemurafenib)备受关注[4]，B-raf基因V600E突变在PTC患者中发生率为28%～83%[5]。因此，对PTC患者行B-raf基因V600E突变检测具有较好的临床指导意义。本文现从操作流程、检测结果等方面对术中冷冻病理组织和石蜡包埋组织两种来源的DNA提取方法进行比较，以确定临床B-raf基因V600E突变更快捷、更准确的检测方法，为PTC患者提供更优质的服务。

1 材料与方法

1.1材料选取2016年4～6月广东省中医院病理科大学城医院术中冷冻病理诊断为PTC的20例患者作为分析对象，分别于术中取其冷冻切片10张(切片5 μm厚)和术后第2天取同一病理号的石蜡包埋组织切片10张(切片5 μm厚)，同时对冷冻和石蜡切片进行HE染色，划取肿瘤细胞富集区域，并进行肿瘤细胞DNA提取。

1.2仪器试剂全自动冷冻切片机、超微量分光光度计ND-8000、全自动组织脱水机(Thermo Scientific公司)；石蜡包埋组织切片机(Leica公司)；全自动染色机(Leica公司)；DNA提取试剂盒(宝创生物公司)；生物安全柜(阿尔泰实验室设备公司)；超净工作台(苏洁净化设备公司)；人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒(武汉海吉力公司)；RT-PCR检测仪(ABI公司)；水平电泳仪(Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(Cambridge公司)。

1.3DNA提取为了防止交叉污染，每一个冷冻病理组织和石蜡包埋组织在实验过程中均严格控制提取条件。切片时确保每块组织使用新的刀片，周围没有其他组织的废屑，将切片贴于未使用过的载玻片上；固定和脱蜡时，确保对每一个组织单独进行固定和脱蜡，固定液和脱蜡液不重复、不交叉使用；PCR实验室分为试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区和产物分析区，DNA的提取在生物安全柜内进行，使用一次性已灭菌无核酸酶的洁净吸头；PCR加样在超净工作台内进行，操作整个过程确保每个标本标记准确，无交叉混淆现象。

1.3.1冷冻病理组织DNA提取 将冷冻切片放置于95%乙醇固定液中固定10 min，再置蒸馏水中5 min复水，转移至装超纯水的小烧杯，采用Biotron DNA提取试剂盒进行提取，具体操作步骤如下：根据术中冷冻HE切片染色结果，将肿瘤细胞富集区域刮取下来，放于装有200 μL ATL的1.5 mL EP管中，然后加入20 μL蛋白酶混合液，吹打混匀；于56 ℃水浴1～3 h或直至组织被消化完全(也可消化过夜)；取出向离心管中加入200 μL变性液AL和200 μL无水乙醇，涡旋混匀后短暂离心；将吸附柱装在收集管中，转移混合液至吸附柱，10 000g离心1 min；倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入500 μL洗涤液GW1至吸附柱中，10 000g离心1 min；倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入650 μL洗涤液GW2至吸附柱中，10 000g离心1 min；倒弃滤液，把柱子装回收集管中，10 000g离心空柱3 min；将吸附柱转移至新的1.5 mL EP管中，加入65 μL洗脱液EB至吸附柱的膜中央，静置1 min，10 000g离心1 min；丢弃DNA吸附柱，应用ND-8000超微量分光光度计对提取的DNA进行浓度及质量测定，其符合标准为1.7< OD260/OD280<2.1，浓度超过100 ng/μL的标本须将浓度稀释到100 ng/μL保存。

1.3.2石蜡包埋组织DNA提取 将石蜡切片按照标准操作规程进行脱蜡，具体过程：二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇 5 min、80%乙醇 5 min、70%乙醇5 min、蒸馏水5 min，合计约1 h。采用Biotron DNA提取试剂盒进行提取，具体操作步骤基本与冷冻切片DNA提取法相同，另需将56 ℃水浴后的标本置于90 ℃继续水浴1 h。

1.4DNA质量鉴定将冷冻病理组织和石蜡包埋组织提取的DNA分别进行质量鉴定，另取血液提取同样浓度DNA标本1例作为阳性对照，DNA洗脱液EB作为阴性对照。分别取5 μL基因组DNA与1 μL 6×Loading Buffer混匀，在1.0%的琼脂糖凝胶孔中进行点样，同时加5 μL Marker进行标记，电泳条件为80 V 60 min。最后在紫外凝胶成像系统下分析电泳结果。

1.5RT-PCR检测B-raf基因V600E突变采用武汉海吉力公司的人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒进行RT-PCR检测，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。每孔DNA上样量为6 ng，PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，合计15个循环；95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，合计31个循环；60 ℃时收集突变信号FAM和内参信号VIC。V600E突变阳性结果判读标准：FAM信号CT值为11～26，且ΔCT值≤6。

2 结果

2.1两种方法提取的基因组DNA质量对比琼脂糖凝胶电泳图显示，20例石蜡包埋组织提取的基因组DNA均较冷冻病理组织提取的DNA降解严重，质量相对较差(图1)。两种方法所得DNA的A260/A280值差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

图1 琼脂糖凝胶电泳图

A.20例石蜡包埋组织DNA；B.20例术中冷冻病理组织DNA；阴性对照为Elute Buffer，阳性对照为血液gDNA

表1 两种方法提取DNA A260/A280值比较

2.2两种方法RT-PCR检测比较20例标本B-raf基因V600E突变检测结果完全一致，其中检测阳性共突变15例，比较15例阳性标本的FAM、VIC信号的CT值和两者的ΔCT值，可以发现冷冻病理组织的FAM和VIC信号的CT值均小于石蜡包埋组织，差异有统计学意义(P<0.05)。两种方法所得阳性结果的ΔCT值，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 两种方法RT-PCR检测结果对比

与石蜡包埋组织相比，*P<0.05

3 讨论

在科技发展技术日益革新的今天，速度是医学技术提升的主要切入点。从石蜡包埋组织中提取DNA是目前临床研究常用手段，其操作简便，实用性强，但是石蜡组织中提取的DNA降解严重[6]，这对临床即时检测提出新的思考。本实验提出术中冷冻病理组织提取DNA的操作方法，实验证明术中冷冻病理组织提取DNA可在发布冷冻报告后2 h内得到DNA，3.5 h内检测完毕并完成临床报告，而石蜡包埋组织还需等到第2个工作日将蜡块包埋好再进行脱蜡、提取，常规脱蜡需1 h且提取过程中需进行90 ℃水浴解除福尔马林固定导致的DNA与蛋白质产生的交联，耗费时间长。

此外，凝胶电泳和RT-PCR检测内参信号VIC值的结果均显示，与石蜡包埋组织DNA相比，术中冷冻病理组织提取的DNA完整性更好，质量更高。本实验结果显示：从术中冷冻病理组织中提取DNA可显著缩短临床检测B-raf基因V600E突变的时间，且DNA质量更优，因此使用该方法可以更快捷、更准确的为临床服务。

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