耳聋研究新动向

杨仕明

中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科 耳鼻咽喉研究所聋病教育部重点实验室全军声损伤防护重点实验室聋病防治北京市重点实验室

1 新的耳聋机制研究

随着对耳聋机制研究的深入，科学家们已从关注耳蜗内各种细胞的损伤，发展到更加细微的耳蜗微环境的变化。耳蜗微环境对于维持听觉上皮功能至关重要，微环境的稳定主要依赖于以下三个机制：K+循环，Ca2+循环及谷氨酸-谷氨酰胺循环共同维持。

在耳蜗内K+循环机制中起重要作用的可能是血管纹，血管纹中的血迷路屏障功能障碍与噪声性听力损失[1]、年龄相关性听力损失[2]、自身免疫性疾病[3]、遗传性听力障碍[4]和内耳的炎性疾密切相关[5]；Ca2+在耳蜗内分布广泛，具有第二信使作用，参与多项耳蜗生理活动，各种因素均可导致Ca2+超载，引发一系列细胞损伤。谷氨酸是耳蜗内毛细胞和I型螺旋神经节神经元之间主要的传入兴奋性神经递质，同时对突触后膜起营养作用；但过量谷氨酸（如噪声引发的免疫反应）会导致谷氨酸-谷氨酰胺循环失衡，导致耳蜗的神经毒性，传入神经树突水肿，严重者可致神经元死亡。多种因素，如噪声、缺氧、遗传等均可导致内环境的改变，使得毛细胞慢慢凋亡或死亡，导致听力损失。我们课题组发现的MITF-M基因突变耳聋猪模型，表现为渐进性听力损失，即为血管纹变薄，内淋巴电位消失，毛细胞于出生后渐进性凋亡或死亡[6，7]。

在噪声性听力损失中，经常观察到血管通透性增加、缺血、白细胞渗透和内皮损伤。PVM/MS(Perivascular Resident Macrophage-like Melanocytes)的激活可能通过减少色素上皮衍生因子的产生而导致血管通透性增加，从而导致紧密连接相关蛋白的下调。在年龄相关性听力损失病例中，毛细血管损伤和退化相当明显。基底膜增厚、PCs(Pericytes)数量减少和PVM/MS形态和功能改变可能导致血迷路屏障功能障碍，从而导致听力丧失。在自身免疫性疾病中，血管纹中的血迷路屏障也是受免疫系统靶向的。例如，自身免疫抗体或循环免疫复合物被发现可导致血迷路屏障破坏和听力缺陷。血迷路屏障组成成分的基因遗传缺陷在多种遗传性听力障碍疾病中存在，包括Norrie病、Alport病、Nr3b2（-/-）、白色斑点（WS）和Varitint-Waddler-J(Vaj)小鼠突变体和连接蛋白缺陷相关听力损失疾病。在炎症引起的听力障碍中，发现血管屏障中的血管纹血管完整性受损。脂多糖（LPS）通过下调紧密连接蛋白而破坏血管纹中的血迷路屏障，通过经血迷路屏障进入外淋巴液的血清荧光素的增加表明此现象。血迷路屏障也是氨基糖苷类、铂类及利尿类等耳毒性药物的靶点[8,9]。这些药物均由血管纹上皮细胞内的转运系统而摄取。

2 新的耳聋干预研究

近年来，针对遗传性听力下降治疗的研究探索了很多全新的方法，其中最为热门的方法包括促进毛细胞再生、干细胞移植以及基因治疗。对于哺乳类来说，内耳毛细胞是一次性的，一旦损失便没有办法补充，而鸟类和鱼类却可以随时产生新的毛细胞。基于这种差别，促进毛细胞再生的研究一直在进行中。目前认为，毛细胞的分化由转录因子ATOH1调节控制。ATOH1位于编码性别决定区基因下游Y-box2（Sox2），EYA1和SIX1。可惜的是，截至目前为止，针对成年的哺乳动物ATOH1调控的研究均未能产生足以恢复听力的毛细胞，且ATOH1的持续表达反而会引起大量的毛细胞凋亡[10]。解放军耳鼻咽喉研究所对听觉生理及聋病进行了长期的系统研究而且在毛细胞再生研究方面也已有一定的积累[11-14]。令人振奋的是，最新研究结果发现，经圆窗膜以重组腺病毒为载体成功将Math1基因导入爆震性聋后豚鼠内耳[15]，发现基因转导后1个月部分豚鼠听力开始恢复，2个月听力则有更好的改善[16]。

另外一个相对热门的方法是干细胞移植。将具有分化能力的干细胞引入听力受损的耳蜗中，通过适当的环境诱导，使其分化成为毛细胞。干细胞的来源包括胚胎干细胞，诱导多能干细胞或从内耳提取的干细胞。由于胚胎干细胞涉及伦理问题，目前用于研究的主要是诱导多能干细胞。尽管在体内和体外均已成功通过诱导使干细胞分化成为毛细胞样细胞，该研究目前仍存在瓶颈，即在干细胞移植后，分化出来的毛细胞并没有集中分布在Corti器，而是杂乱分布，并且成活率很低[17]。

随着人类基因组计划及精准医学计划的实施，人们对遗传性聋的认识也在分子水平上取到突破。近年来，非综合征型耳聋逐渐被认定为一种单基因病。利用基因编辑的方法，通过对实验动物进行基因编辑从而获得基因缺陷动物，或对已有的基因缺陷动物进行基因纠正是现阶段探索单基因遗传病最为普遍和有效的研究方案。随着CRISPR/Case9技术的应用和推广，短短的几年时间内，基因编辑技术广泛应用于各种遗传性耳聋的疾病机理、临床表现和治疗探索的动物模型构建中。小鼠是用于研究人类遗传性耳聋的应用最为广泛的动物模型。针对Vglut3(SlC17A8)的基因治疗是目前文献报道的第一例成功的哺乳动物毛细胞基因治疗案例[18]。针对常染色体遗传的 Tmc1[19]，Ush1C[20]，Gjb2[21]均有利用小鼠模型成功的进行基因治疗的文献报道。

3 新的耳聋动物模型研究

动物模型是基础生物学和人类疾病机理研究的基本工具，也是疾病防治研究和治疗手段开发的必经之路基石所在。建立合适的耳聋动物模型是研究其发病机制和治疗手段的一个十分重要的方法，现已构建的耳聋动物模型主要是小鼠、豚鼠和大鼠。尽管采用啮齿类动物建立耳聋动物模型有很多的优点，但是这些模型本身也存在着难以克服的缺陷，使其不能完全满足医学研究的需要，例如，啮齿动物在物种亲源性、解剖结构、进化速率和代谢率等方面都和人类有着较大的差异，并且对于耳蜗内部各个病变部位的取材和观察都存在着较大的技术困难。因此我们迫切需要寻找一种新型的、更加优良的大动物耳聋模型。

小型猪作为大型哺乳动物模型在耳科学研究中具有重要地位和广阔的应用前景[22]。首先，小型猪的内耳结构和听觉生理特征与人类相似，大量研究显示其中耳听骨链、内耳耳蜗螺旋器和螺旋神经节等颞骨解剖结构以及听阈、敏感听力范围等较小鼠、豚鼠等和人类颞骨及听觉系统相似性更高[23-28]，目前已经建立完善的小型猪听觉数据库和小型猪人工耳蜗植入的标准化数据[29]，特别适合耳外科手术操作基础训练和听觉生理相关研究。其次，小型猪可植入人用电子耳蜗，是一种理想的研究听觉植入的大动物模型。再次，目前已经建立的一系列小型猪耳聋模型，与人类感音神经性耳聋具有较高的相似性。我们已经通过噪声暴露方法、乙基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）化学诱变方法和基因编辑技术构建了小型猪噪声性聋、Mondini畸形、单侧聋、MITF突变、大前庭水管综合征等一系列小型猪模型，为研究噪声性耳聋及遗传性耳聋发病机制奠定了基础[30-32]。

近年来，我国耳科学事业蓬勃发展，对新的耳聋机制的研究，对新的耳聋干预方法的研究，对新的耳聋动物模型的研究，完美的将基础研究与临床应用相结合，极大地保障了人民的健康，提高了民众的生活质量。放眼世界，举目未来，虽然我们仍面临着很多困难，但应肯定耳科学同仁们所取得的成绩，戒骄戒躁，继续努力。