数字PCR技术及其应用

杨 茜

（大连医科大学检验医学院，辽宁 大连 116044）

1985年K.Mullis发明的聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction，PCR），可以在体外模拟体内核酸的合成过程，大大缩短了实验周期、降低科研成本，是生命科学领域的一项革命性壮举。但传统的PCR技术也有弊端，仅能进行半定量测定，在分析产物时需要进行开盖操作，容易产生假阳性[1]。随着科学技术的发展，能够实时定量检测核酸的实时荧光定量PCR技术（quantitative PCR，qPCR）、数字PCR技术（digital PCR，dPCR）也相继出现，一举攻克传统PCR的技术难题。而数字PCR凭借其高通量、高准确度的特点，有着极为广泛的应用前景[2]。

1 数字PCR技术的原理

数字PCR技术包括两部分，PCR扩增以及荧光信号分析。它的原理是将含有DNA模板的反应体系稀释分离成单分子，分配到大量的反应单元中进行PCR扩增反应，采集每个反应单元的荧光信号，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0。通过阳性微滴的比例或泊松分布公式计算样本的原始浓度或拷贝数，最终获得结果[3]。

2 数字PCR技术分类

数字PCR的灵敏度取决于检测器的灵敏度、PCR扩增效率以及反应单元的数目。根据反应单元形成的不同方式，将PCR技术分为三类系统：

2.1 微反应室数字

PCR是在不锈钢芯上刻蚀了数以千计的微反应室，同时也将每个反应单元的体积从微升级降至纳升级，提高了样品同量，但需要借助高通量的自动点样仪，提高了仪器成本和操作复杂性[4]。

2.2 微流控芯片数字

PCR是建立在微流体技术、纳米制造技术和微电子技术等发展之上的，它的出现为我们提供了一个实现低成本、小体积和高通量PCR分析的理想平台[5]。

2.3 液滴数字

PCR系统是在扩增之前进行微滴化处理，以极低的浓度包裹于油水两项形成的数万个纳升至皮升级液滴中，每个液滴都是一个独立的反应体系，扩增后的产物富集在磁性微球上，破乳后收集进行测序[6]。该技术的优势在于，能够把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中，避免了引物与引物之间、不同产物之间的相互影响[7]。同时可以在不同的反应室中进行同时扩增，实现了高通量测定。

3 数字PCR技术应用

3.1 病原微生物的检测

目前医院主要通过qPCR对血液、脑脊液等临床样本进行病原微生物的检测，但qPCR仍存在较多缺点：不同实验室标准品或者对照品之间存在误差，导致实验室内或者不同实验室之间qPCR的检测结果有差异，需建立统一标准曲线[2]；Yan[8]等采取感染H7N9的患者十个不同治疗时期的样本，分别进行qPCR及dPCR检测，发现对于qPCR阴性的样本，dPCR仍可以检测出病毒的存在，说明dPCR的灵敏度远高于qPCR。数字PCR不仅可以对病原体定性，而且还能对病原体DNA或RNA序列进行绝对定量，从而对疾病进行早期诊断、药物疗效观察、病情判断及预后观察，目前数字PCR技术已广泛的应用于HBV、HIV、甲型流感病毒等临床领域[9]。

3.2 肿瘤诊断

许多肿瘤早期就出现癌基因的突变和表达异常，dPCR技术不仅能有效地检测到癌基因的突变，而且可以准确定量其表达。如肺癌表皮生长因子受体、神经胶质瘤异柠檬酸脱氢酶及葡萄膜黑色素瘤突变的检测[9]。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，其与癌症也密切相关[10]。田辉等人[11]建立了一种基于连接反应的微滴式数字PCR检测单细胞中miRNA，这与研究与miRNA有关的疾病有着重要的意义。

3.3 产前诊断

产前诊断可以在出生前对胎儿的发育状态、患有的疾病等方面进行检测。传统的侵入方法如羊水穿刺和绒毛取样，存在让孕妇流产的风险[10]。1997年，LO[12]发现了存在于孕妇外周血的胎儿游离的cffDN A，为无创产前诊断提供了新的思路。2017年，LO[13]利用数字PCR进行了cffDNA的异常分析，用于21三体综合征的诊断，上述方法可检测血液中25%的胎儿基因。Barrett[14]利用cffDNA进行了镰状红细胞贫血的检测。

dPCR作为一项新的技术，还存在许多问题需要解决和探讨。相信随着科技的进步与技术的革新，该技术定将广泛的应用在生命科学的各个领域。