中扣带回-后岛叶通路调控痛觉超敏反应

研究背景

人类和啮齿类动物影像学研究表明，扣带回在疼痛感觉过程中处于持续激活状态。啮齿类疼痛模型动物前扣带回(ACC)体外电生理实验结果显示，ACC与疼痛记忆有关。然而，基于细胞结构、神经化学、纤维联系以及不同的活动模式区分扣带回亚区的功能研究仍很少，并且这些解剖学的差异如何转化为功能上的差异仍是未知。尽管疼痛异常敏感病人MCC呈持续激活状态，但是MCC在疼痛中的作用并不明确。此外，关于其通路及作用区域的机制研究也未见报道。该研究在清醒的小鼠上进行光遗传操作、环路研究和功能性评估，讨论了MCC在伤害性感受、急性疼痛和疼痛过程中亚急性可塑性中的具体作用。

主要研究结果

该研究使用重组Camk2a启动子的腺病毒载体(rAAV-CaMKII-ArchT-Venus)将古紫质质子泵（ArchT，黄光控制）和光敏感通道视紫红质蛋白2（ChR2，蓝光控制）导入MCC全层来抑制或刺激MCC神经元活动，光纤的最佳位置通过c-Fos表达情况来确定，并通过全细胞膜片钳和体内四极电极记录来检测操纵神经元活动的有效性。

将辣椒素注入小鼠后爪后， MCC各层神经元中c-Fos蛋白表达显著增加。在辣椒素注射后15～30 min内，黄光激活ArchT以阻断MCC神经元活动，c-Fos表达细胞数量显著减少。但是辣椒素诱发的急性疼痛行为并没有减轻。黄光作用于表达ArchT的大脑第一躯体感觉皮质后肢区(S1HL)时也产生相似的结果。使用双纤维方法同时抑制MCC和S1HL也不会影响辣椒素诱发的急性疼痛行为，这表明辣椒素诱发的急性痛存在多种通路。

同样，ArchT介导的MCC或S1HL抑制对足底机械性刺激（von Frey纤维）引发的后爪急性缩腿行为没有影响。同时抑制MCC和S1HL神经元活动，小鼠对有害和无害机械性刺激的敏感性增强，这一作用仅发生在黄光照射的时间内，此后并没有持续。该结果表明，MCC与第一躯体感觉区(S1)共同参与疼痛抑制通路的紧张性调节。

接着，研究者在伤害性活动诱导的中枢可塑性模型中探讨了MCC和S1HL的功能。利用病毒注射小鼠，研究者观察到MCC和S1HL的活动对于C纤维伤害性感受器诱发中枢可塑性是必需的。在后爪注射辣椒素后15～30 min内抑制MCC或S1HL活动并用von Frey纤维刺激，发现机械性痛觉过敏消失。然而，在辣椒素注射后45～60 min接受机械性刺激，对照小鼠（仅接受光纤植入）和S1HL抑制小鼠表现出明显的高敏感性，而MCC 抑制小鼠则没有这种表现。表明MCC而非S1HL皮层神经元的持续兴奋在痛觉过敏的维持过程起作用。

在辣椒素注射后15～30 min仅在机械性刺激期间抑制MCC活动，痛觉超敏反应受到抑制，但在45～60 min又完全恢复持久性痛敏。这表明，与刺激无关的MCC神经元持续活动对于与痛觉敏化有关的皮质回路的长期兴奋非常重要。体内电生理记录也显示，在辣椒素注射后15～30 min后，痛觉超敏行为明显，MCC活动持续增加。

为了探讨MCC持续兴奋性活动对伤害性活动诱导的中枢可塑性的影响，研究者在辣椒素注射后不同阶段对MCC进行了抑制。在辣椒素注射后0～15 min（痛觉感受器激活期）持续抑制MCC神经元活动，在15～30 min时完全阻止了机械性超敏反应。然而，这些小鼠在45～60 min时又出现了机械性痛觉超敏现象，尽管明显低于对照小鼠。为了确定这是否由MCC神经元的持续兴奋引起，研究者仅在辣椒素注射后30～45 min内抑制表达ArchT小鼠的MCC活性，发现在45～60 min时显著降低了机械敏感性。

相反，在表达ArchT和ChR2的小鼠，在局部注射辣椒素后15～30 min内用黄光刺激，在45～60 min内以蓝光(473 nm) 刺激MCC（激活MCC神经元），小鼠机械性痛觉敏感性显著增强，这和记忆的恢复过程类似。这些结果表明，在急性外周C伤害性纤维激活后，MCC神经元在不同时相的持续活动对于诱导和维持痛觉过敏反应相关的中枢可塑性来说是必需的。

研究者测试了急性抑制MCC是否可以逆转已经形成的长期超敏反应。在足底注射完全弗氏佐剂(CFA)诱导的长期炎症性疼痛模型中，在CFA后24小时，黄光照射ArchT表达小鼠的MCC，部分但显著地减轻了机械性痛觉过敏。与此相反，周围神经病变（坐骨神经损伤模型，SNI）引起的机械性异常疼痛在很大程度上不受急性抑制MCC的影响，这表明MCC对长期疼痛具有选择性作用，炎性痛与神经病理性疼痛引起的机械性痛觉超敏具有不同的中枢机制，而MCC参与炎性痛诱发的机械性痛觉超敏。

接下来，研究者检测了MCC活动本身是否足以诱导行为可塑性改变。在表达ChR2小鼠MCC切片，持续15 min的全细胞记录显示，在整个15 min的光照周期内，锥体神经元持续激活，与蓝色光照强度改变成正比。与10 Hz相比，在20 Hz和30 Hz频率下MCC神经元的动作电位明显增加。在清醒的表达ChR2小鼠上进行了同样的实验，观察到在同侧和对侧MCC中c-Fos表达神经元的数量明显增加。用蓝光激活表达ChR2小鼠MCC神经元，同时以von Frey纤维机械性刺激爪底，发现小鼠出现明显的机械性痛觉超敏行为，这类似于外周伤害性刺激诱导的痛敏。

本文作者之后研究了MCC环路是否参与中枢可塑性。在研究的10个与疼痛感觉有关的脑区中，只有伏隔核(NAc)、后岛叶(PI)以及邻近脑区屏状核c-Fos表达模式呈双向调控，这与在无辣椒素时通过ChR2激活MCC或通过ArchT抑制MCC联合足底注射辣椒素时痛觉超敏反应的双向变化一致。研究者还观察到内侧丘脑的活性在MCC激活和辣椒素处理时都没有变化。尽管在追踪实验中，研究者观察到基底外侧杏仁核在结构上接受来自MCC兴奋性神经元的传入，但在杏仁核中并未看到特异性的MCC驱动的c-Fos蛋白表达。在与MCC有解剖关系的前额前边缘和下边缘皮层，抑制MCC几乎完全抑制辣椒素诱导的c-Fos表达。然而，直接光刺激MCC并没有引起边缘前皮层和边缘下皮层产生明显的c-Fos表达，这提示连接的复杂性和间接性。同样，前岛叶、S1HL和中央杏仁核在抑制和激活MCC时，c-Fos表达没有出现双向变化。因此，只有PI和NAc表现出c-Fos表达的双向变化，与MCC活性的双向变化高度吻合。因此，研究者推测从MCC到PI和NAc的下行投射会影响痛觉可塑性和痛觉过敏的诱导。

为了进一步研究激活的MC-PI和MCC-NAc投射是否在功能上参与了痛觉过敏的诱导，研究者利用光遗传技术直接刺激或抑制MCC到PI或NAc的投射。首先，用表达改良的ArchT即 eArchT的腺病毒来感染单侧MCC神经元。然后，在对侧后肢注射辣椒素激活MCC后15～30 min的行为测试中，通过在目标区域（PI或NAc）放置光纤进行光照抑制表达。抑制单侧MCC-NAc投射在早期阶段仅对对侧后爪的机械性超敏反应产生很小的影响，并且在后期的测试中并没有效果。与表达GFP的小鼠相比，表达eArchT小鼠用黄光照射单侧MCC-PI投射，不仅在注射辣椒素后15～30 min，而且在45～60 min明显抑制了对侧后爪的机械性超敏反应。在另一组小鼠中，直接抑制MCC-PI通路的靶区即PI神经元，辣椒素诱导的机械痛觉超敏反应被抑制。在没有辣椒素刺激的情况下，抑制MCC-PI投射后基础痛觉敏感性没有变化。因此，抑制PI再现了抑制MCCPI投射所引起的主要表型变化。

在第二种方法中，研究者通过病毒使MCC兴奋性神经元表达ChR2，并将光纤分别置于投射区PI或Nac来直接光照激活MCC-PI投射和MCCNAc投射。与只表达GFP的小鼠相比，蓝光照射表达ChR2的MCC-PI投射，而不是表达ChR2的MCC-Nac投射，在无后爪注射辣椒素的情况下，诱导了显著的机械性超敏反应。因此，直接刺激MCC-PI投射，而不是MCC-NAc投射，很大程度重现了刺激MCC兴奋神经元时观察到的超敏反应。

调节MCC-PI或MCC-Nac投射并没有影响运动机能和功能，说明这些行为结果没有受到运动功能的明显干扰，而且MCC-PI投射并不参与MCC引发的恐惧反应。

最后，研究者试图探讨MCC和MCC-PI通路是否仅通过脊髓上机制导致伤害性行为的敏化，或者它们是否通过下行调制作用于脊髓伤害性过程。研究者用30 Hz刺激表达ChR2小鼠MCC神经元或MCC-PI投射。光遗传激活ChR2表达小鼠MCC或MCC-PI通路诱导发生明显的超敏反应，但对鞘内注射格拉司琼（5-HT拮抗剂）的小鼠却没有作用，表明在MCC以及MCC-PI通路的促疼痛功能中，下行5-HT起重要作用。单独注射格拉司琼对基础机械性痛敏无影响。荧光共聚焦显微镜显示，PI发出兴奋性投射至中缝大核（下行5-HT能投射的起点）。这些都提示MCC-PI通路作用于下行5-HT易化系统而诱发机械性痛觉超敏。

综上所述，MCC-PI投射在C纤维激活后产生并维持伤害性痛觉超敏反应，在缺乏条件性伤害性传入的情况下，激活MCC-PI通路足以诱发痛觉超敏，并且不引起刺激依赖的恐惧或负面情绪。

讨 论

关于扣带回亚区功能的划分仍不清楚。尽管关于人类影像学已经证明ACC亚区与疼痛、厌恶情绪具有广泛的相关性，但是由于缺乏干预操作，它们与痛觉超敏之间的因果联系尚不明确。该研究结果揭示了MCC脑区可以调控小鼠的痛觉过敏，但不能调控小鼠的急性疼痛或与情感相关的行为。

虽然光遗传学不能同时靶向整个MCC所有的神经细胞和亚区，但是在被照射区域内控制80%的兴奋性神经元的活动就足以调节痛觉可塑性，但不能调节急性疼痛或情绪。对ACC在啮齿类动物疼痛中的作用研究表明，ACC在疼痛相关负面情绪中具有特异性作用，但在疼痛感觉中却不起作用。大多数关于扣带回功能对痛觉影响的研究都是针对于rACC，而该研究着眼于MCC，并基于靶向特定功能的亚区和阐明环路的作用，在细胞神经网络水平分析疼痛的不同组成部分。

研究数据显示，虽然S1皮质和MCC对于强烈的痛觉传入诱导早期行为可塑性很重要，但是只有MCC兴奋性神经元的持续活动才会在中止外周传入后过渡到亚急性痛敏的维持中起作用。关于病理性疼痛状态的长期可塑性，研究者观察到MCC对炎症性疼痛和神经性疼痛的不同作用。尽管这两种慢性疼痛状态都涉及中枢可塑性，但人们普遍认为，它们的机制和潜在途径存在很大差异，不仅涉及到周边传入因素，还涉及到参与中枢神经环路。目前，胶质细胞依赖性的机制和与情感、情绪和奖赏相关的环路是神经性疼痛的决定因素。该研究观察到急性抑制MCC神经元可以部分地但是明显地逆转炎症性痛觉过敏。

通过光遗传抑制或激活MCC，暂时控制MCC活动以及基于c-Fos的脑区描绘，研究揭示了MCC是调节超敏感状态环路的关键点，为MCC在受到刺激时能快速作出行为适应控制提供了功能证据，这些已经在人类影像学研究中得到了预测。基于c-Fos的活动图谱，研究者观察到MCC相关网络跨越几个皮层和皮层下区域，包括最近被证明可以调节中枢疼痛处理的前额皮质的其他区域。然而，功能联系最明确的是MCC与PI、NAc和屏状核。

该研究尚未确定MCC和MCC-PI通路是如何控制感觉过敏的。有几种可能的机制，如调节预期的神经网络（包括MCC而非rACC），影响注意力，调节特殊神经网络（其中包括MCC作为接头），调节上行脊髓丘脑和丘脑皮质伤害性信息传入到PI，或者通过下行控制途径调节脊髓伤害性信息处理过程。MCC在解剖学上也与扣带运动前区有关，该区域被认为是可以直接控制对刺激威胁作出适应性运动反应。最近的研究表明，在疼痛期间激活的MCC脑区和运动控制脑区之间存在紧密的重叠。有多条证据显示PI与编码强度有关，因此，MCC-PI连接可能利用PI的这一功能在疼痛过程中增强疼痛感觉。MCC调控痛觉过敏的最终下游过程是通过脊髓痛觉加工的下行易化来实现的，而不是依赖于上述MCC激活后的脊髓上机制。事实上，PI在解剖学上和功能上都与中缝大核相关，这是5-HT能调控的起点。研究者发现MCC-PI通路通过招募下行5-HT能机制来影响痛觉。起源于中缝大核的5-HT能通路在脊髓中发挥了显著的促进调节作用，最近有报道称，光遗传激活脑干5-HT能神经元可诱发痛觉过敏。

关于皮层可塑性是否仅仅反映了在痛觉通路初始部分的活动依赖性致敏现象，或者皮层的结构和功能可塑性是否会导致病理性疼痛，还存在争论。该研究认为仅激活MCC-PI投射，就能产生不依赖于外周伤害性信息传入的痛觉过敏。这对没有明显损伤或身体疾病的病人的疼痛敏感性的变化（或是在治疗后的持续疼痛）具有重要意义。因此，该研究为心理社会因素加重疼痛提供了一种可能机制，这些因素可能会抑制MCC和PI的基本活动。综上所述，该研究结果提示皮层神经环路参与从急性疼痛到长期疼痛的转变。