扶正祛毒方对慢性乙肝病毒携带者血IFN-γ表达影响的研究

郭子宁 张立平 黄象安 彭龙 金艳

慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)携带者具有“HBV高水平复制”和“转氨酶正常或低水平”两大特点，结局高危，需要早期干预已经成为共识[1]。目前研究认识到其核心机制为免疫耐受[2]，遗憾的是，当前除了早期随访，定期观察外无有效治疗手段。中医药具有多靶标、双向调节作用，近年来在诸多疑难问题上取得可观成绩，具备深入研究价值。扶正祛毒方以扶正祛毒立法，课题组早期在临床及实验中观察到其抑制HBV复制和保护肝细胞的作用，本研究拟观察其对慢性HBV携带者的治疗作用，探讨其对在免疫清除机制中起关键作用的细胞因子干扰素(interferon-γ,IFN-γ)表达的影响。

1 对象与方法

1.1 对象

选取2015年10月～2017年4月期间来北京中医药大学东方医院肝炎门诊就诊，年龄18～65岁，符合慢性HBV携带者诊断的患者，诊断标准参照《2010版中华医学会肝病学分会、感染病学分会联合修订的“慢性乙型肝炎防治指南”》，排除同时感染其他类型肝炎、HIV者；合并有其他脏器的衰竭，如心、肾功能衰竭，以及精神疾病、恶性肿瘤等疾病者；患有自身免疫系统疾病如原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎者；入组前6个月内有干扰素或核苷类抗病毒药物以及免疫增强或抑制剂的用药史者；妊娠或哺乳期以及3个月内参加过其他临床试验者。知情同意后入组，共入组30例，失访4例。

1.2 试验药物

扶正祛毒方由黄芪30 g、当归15 g、蒲公英15 g、半枝莲15 g、郁金10 g、白花蛇舌草15 g、醋柴胡10 g、炙甘草6 g组成，制备成200 mL汤剂，2密封袋分装，由北京中医药大学东方医院药学部完成鉴定和制备，4℃冷藏。服用方法为早、晚各1袋，餐后半时口服，连续服药12周。

1.3 主要仪器与试剂

全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，产地美国)，电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特)，MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)，HBeAg及 IFN-γELISA试剂盒(批号20170715，均购自联科生物试剂公司)。

1.4 检测指标

取血清后，全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平；RT-PCR法检测HBV DNA滴度：采用罗氏(LightCycler 480)实时荧光定量扩增仪，加处理液a，离心，弃上清后提取蛋白，加处理液b震荡混匀，高温解链，离心提取核酸，取细管加酶18 μL，提取液2 μL，离心后，上机扩增，读取荧光标记物含量；ELISA测HBeAg及细胞因子IFN-γ表达：按试剂盒说明书包被，加样，加酶标抗体，底物液显色，根据颜反应来判定HBsAg、HBeAg以及IFN-γ的含量。

1.5 观察时点

分别于患者入组第1天、用药后第12周末空腹采血。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 扶正祛毒方对慢性HBV携带者疗效判定指标的影响

由于差值不符合正态分布，选用非参数检验(Wilcoxon)，结果显示，扶正祛毒方治疗12周后，患者HBV DNA复制水平较治疗前下降，差异显著(P<0.05)，见表1。与此同时，患者血清HBeAg亦较前下降，差异显著(P<0.05)，见表2。

2.2 扶正祛毒方对慢性HBV携带者血清细胞因子IFN-γ表达的影响

结果显示，扶正祛毒方治疗12周后，慢性HBV携带者血清细胞因子IFN-γ表达较治疗前上升，差异显著(P<0.05)，见表3。

表1 扶正祛毒方治疗前后血清HBV DNA复制的变化

表2 扶正祛毒方治疗前后血清HBeAg的变化

表3 扶正祛毒方治疗前后血清IFN-γ表达的变化

3 讨论

慢性HBV携带者指HBV慢性感染后肝脏无明显炎症活动的携带状态，多为处于免疫耐受期的HBsAg、HBeAg、HBV DNA阳性者，血清ALT、AST在正常范围，肝组织学检查无明显异常，常隐匿进展为肝硬化或肝癌，被称为“高危结局HBV携带者”[3]。虽然早期干预慢性HBV携带者已经成为业内共识[4]，但由于本期免疫无应答，此期治疗一般无疗效，因此目前指南只建议做定期随访。近年来中医药在临床尤其是个案中取得良好成效，主要体现在对病毒复制的抑制作用，维持转氨酶正常水平，对肝纤维化逆转作用等[5]。

课题组认识到慢性HBV携带者“正虚毒伏”的病机关键，从正虚毒伏与免疫耐受病理基础的相通性出发，扶正祛毒，以期打破免疫耐受，抑制病毒复制的同时避免肝脏炎性损伤。本研究结果显示，扶正祛毒方治疗12周后，HBV DNA的复制、HBeAg的表达均明显下降。HBV DNA是反应HBV复制与否最直接的指标，也是临床诊断、疗效判定的关键；HBeAg表达的强弱则提示病毒复制的程度和传染性强弱，结合试验结果，提示扶正祛毒方抑制HBV复制的作用是肯定的，与此同时，患者血清转氨酶水平在正常范围，转氨酶是反映肝脏功能的重要指标，也是肝脏炎症活动最灵敏的指标之一，结果显示，扶正祛毒方对慢性HBV携带者肝功能无不良作用。

IFN-γ是活化细胞免疫，清除病毒的效应细胞因子。研究表明，IFN-γ可以通过多个环节抑制HBV DNA的复制。包括阻止HBV核衣壳的形成,促进其在肝细胞浆中降解、清除HBV核衣壳颗粒及其包装的HBV复制中间体，影响RNA的正常转录和翻译。IFN-γ还可以通过与靶细胞表面的相应受体结合，诱导靶细胞合成抗病毒蛋白(antiviralprotein,AVP)如蛋白激酶(protein kinase resource,PKR)，抑制HBV复制而不损伤肝靶细胞，介导非肝细胞损伤的抗病毒作用，IFN-γ清除HBV的过程被认为可以完全独立于肝脏损伤的过程[6-7]。因此，IFN-γ表达的升高，有助于清除病毒，抑制其复制。本研究结果显示，扶正祛毒方治疗12周后，血清IFN-γ表达上升，相应的，HBV DNA的复制明显下降，这意味着扶正祛毒方可能是通过上调IFN-γ，活化免疫，从而抑制病毒复制的。

值得思考的是，虽然本研究显示扶正祛毒方可以抑制慢性HBV携带者病毒复制，但治疗前较治疗后下降约1log值，这与指南所界定的抗病毒药物的有效标准仍有距离，可能是由于如下原因：(1)治疗时间较短，未达到指南判定疗效的时间节点24周；(2)扶正祛毒方以扶正祛毒为立法，旨在调节免疫耐受状态，这与核苷(酸)类抗病毒药物的作用机理是不同的。从长远来看，扶正祛毒方从慢性HBV携带者免疫耐受的核心机制出发，安全、有效，其远期疗效值得期待，其作用机制更具深入探讨的价值。

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[3] Han-Min Li,Xiang Gao,Mu-Lan Yang, et al.Effects of Zuogui Wan on neurocyte apoptosis and down-regulation TGF-β1 expression in nuclei of arcuate hypothalamus of monosodium glutamate-liver regeneration rates[J].World Journal of Gastroenterology,2004,10(19):2823-2826.

[4] 郭子宁,张立平,黄象安.扶正祛毒法在慢性乙型肝炎病毒携带者中的应用及展望[J].国际流行病学传染病学杂志,2017,44(3):206-209.

[5] 孔祥廉,林慧,盖丽丽,等.中医药治疗乙型病毒性肝炎研究进展[J].时珍国医药,2009,20(3):615-617.

[6] Suri D,Schilling R,Lopes AR,et al.Non-cytolytic inhibition of hepatitis B virusreplication in human hepatocytes[J].Hepatol,2001,35(6):790-797.

[7] Sitia G,Isogawa M, Iannacone M,et al.MMPs are required for recruitment of antigen-nonspecific mononuclear cells into the liver by CTLs[J].J Clin Ivest,2004,113(8):1158-1167.