保肾通络方对早期糖尿病肾病大鼠尿蛋白及尿Nephrin、Podocin排泄的影响

唐珑 王悦芬 赵文景 孙雪艳 崔方强 孟元 赵静 蔡朕 王晖 申子龙

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)早期的临床表现以微量白蛋白尿为主，研究证明蛋白尿不仅是肾小球足细胞功能紊乱的结果，也是肾损害进展的独立危险因素[1]。如果得不到及时有效的治疗，患者很快会出现大量蛋白尿，并伴有肾功能进行性下降，最终进展至终末期肾衰竭，一定程度上增加了患者的病死率[2-3]。足细胞及其相关分子的损伤在糖尿病肾病早期及微量蛋白尿的发生发展中起着关键的作用，其中Nephrin、Podocin作为足细胞裂孔隔膜上的跨膜蛋白，在维持足细胞形态及肾小球滤过屏障功能中意义重大。保肾通络方是在北京中医医院肾病科协定处方保肾方Ⅱ号(生黄芪、生地黄、女贞子、水蛭等)加用虫类药(蝉蜕、地龙、全蝎)组方而成，基础研究与临床应用均验证其为治疗糖尿病肾病有效中药方剂，本研究旨在通过观察不同剂量的保肾通络方对早期DN大鼠尿液中Nephrin、Podocin排泄的影响，初步探讨保肾通络方对早期糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用与最佳治疗剂量。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物

SPF级健康雄性SD大鼠35只，体重200～240 g，鼠龄6～8周龄，由北京市中医研究所动物室提供(合格证书编号：11400500012601)。

保肾通络方由生黄芪30 g、党参15 g、生地黄30 g、女贞子20 g、菟丝子20 g、鬼箭羽15 g、三棱10 g、水蛭5 g、蝉蜕9 g、地龙6 g、全蝎6 g组成，水煎剂，4℃冰箱保存，每3天配置一次。药材由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供；盐酸贝那普利片，由北京诺华制药有限公司生产(规格：10 mg×14片，国药准字:H20030514)。

1.2 实验试剂与仪器

链脲佐菌素(streptozocin,STZ，美国，Sigma)；柠檬酸、柠檬酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；尿Nephrin Elisa试剂盒、尿Podocin Elisa试剂盒(北京鸿跃创新科技有限公司)等。FreeStyle®血糖仪及试纸(美国，Abbott)；低温冰箱(美国，Thermo)；MultiSkan3酶标仪(美国，Thermo)；全自动生化分析仪(美国，Beckman Coulter)。

1.3 动物模型的建立与分组

大鼠适应性饲养1周，随机抽取7只为空白组，其余为模型组。造模前禁食不禁水4小时，模型组单次左下腹腔注射1%链脲佐菌素溶液(以0.1 mol/L柠檬酸缓冲液冰上配置，pH 4.2～4.5)55 mg/kg，空白组注射等量的柠檬酸缓冲液。造模48小时内给予5%葡萄糖饮水，72小时后尾尖采血，血糖仪测定随机血糖浓度≥16.7 mmol/L且血糖水平维持一周者确定为糖尿病大鼠模型。将糖尿病模型大鼠随机分为五组，每组7只。其中中药组给予保肾通络方(高剂量组20.4 mg·kg-1·d-1、中剂量组10.2 mg·kg-1·d-1、低剂量组5.1 mg·kg-1·d-1灌胃，正常组及模型组给予等量蒸馏水灌胃。每日1次，连续给药8周。

1.4 标本采集与检测

给药后的第8周末，血糖仪测取大鼠尾尖随机血糖(blood glucose，BG)；所有大鼠分别放置代谢笼12小时，收集并记录尿量，3000 r/min离心10分钟，全自动生化分析仪测定尿糖(urine glucose，UG)。按Elisa试剂盒说明用酶联免疫吸附法测定大鼠尿Nephrin浓度、尿Podocin浓度、尿白蛋白浓度(urinary albumin，U-ALB)。全自动生化分析仪测定尿肌酐(urea creatinine，Ucr)；为减少尿量的影响，尿Nephrin、尿Podocin及尿白蛋白浓度均以尿肌酐校正，分别表示为UALB/Ucr(UACR)、UNE/Ucr(UNECR)、UPO/Ucr(UPOCR)；分别比较UNECR、UPOCR与UACR的相关性。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

实验期间，模型组大鼠逐渐出现不同程度的进食及饮水量增加，尿量明显增多，消瘦，毛色泽枯黄，活动迟缓。后期相继出现白内障、口足溃疡等并发症，中药各剂量组以上情况均有不同程度的改善。

2.2 各组大鼠血糖与尿糖的比较

模型组的血糖与尿糖均高于正常组，证明造模成功；经治疗后，模型组及中药各剂量组的血糖与尿糖水平明显高于正常对照组(P<0.05)；与模型组比较，中药组血糖与尿糖均有所下降，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血糖及尿糖比较

注： 与正常组比较，aP<0.05。

2.3 各组大鼠尿白蛋白排泄的比较

8周末，模型组及中药组大鼠UACR明显高于正常组(P<0.05)；各剂量中药组UACR均较模型组有所降低(P>0.05)，其中中药中剂量组分别低于中药低剂量组与中药高剂量组(P>0.05)，但中药各剂量组组间差异无统计学意义。见表2。

2.4 各组大鼠尿Nephrin、Podocin排泄的比较

8周末，模型组及中药组大鼠UNECR及UPOCR明显高于正常组(P<0.05)；中药各剂量组UNECR较模型组减少，其中中药中剂量组、中药高剂量组较模型组明显下降(P<0.05)，中药中剂量组与高剂量组组间差异无统计学意义(P>0.05)；中药各剂量组UPOCR较模型组减少，但差异无统计学意义(P>0.05)；其中中药中剂量组UPOCR低于中药低剂量组与中药高剂量组，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.5 大鼠UNECR、UPOCR与UACR相关分析

经Pearson相关分析，UNECR与UACR呈正相关(r=0.746，P<0.05)；UPOCR与UACR呈正相关(r=0.517，P<0.05)。见图1、2。

表2 各组大鼠UACR、UNECR、UPOCR比较

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

图1 尿Nephrin与尿微量白蛋白的相关性分析

图2 尿Podocin与尿微量白蛋白的相关性分析

3 讨论

Nephrin、Podocin是足细胞裂孔隔膜的主要跨膜蛋白，参与细胞信号传导、调节细胞骨架重塑，在维持足细胞与肾小球滤过屏障完整性上发挥了重要的作用[4]。足细胞相互交叉的足突与隔膜裂孔共同覆盖在肾小球基底膜的表面，维持着较大的滤过面积，是阻止蛋白渗漏入尿的最后一道屏障[5]。足细胞相关分子的异常表达已被证明与糖尿病肾损伤及蛋白尿相关[6-8]。各种原因引起的Nephrin、Podocin的损伤、移位或表达减少都会影响足细胞内骨架蛋白重排和相连蛋白功能，导致足突变宽、融合，裂孔隔膜破坏、疏松甚至消失，最终产生蛋白尿。近年来，大量证据表明糖尿病肾病患者及动物模型的肾脏组织中Nephrin、Podocin表达下降，而尿中足细胞相关因子的研究也逐渐成为热点[9]。研究证明足细胞损伤并脱落进入尿液是糖尿病肾病蛋白尿发生的一个重要因素[10]。动物实验发现尿Nephrin的表达可以作为肾小球损伤的早期迹象，并且常常先于蛋白尿出现。临床研究亦证明尿Nephrin水平与尿蛋白呈统计学相关性，糖尿病患者尿Nephrin排泄明显高于非糖尿病患者，并与足细胞损伤的严重程度呈正相关[8,11-12]。尿中Podocin会随DN的进展而增加，Podocin与血肌酐呈正相关，在一定程度上反映了DN进展中蛋白尿和肾功能损害的严重程度[13]。Wickman等[14]通过临床对比发现通过尿肌酐校正后的尿Podocin(UPOCR)表达与肾小球的损伤程度密切相关，UPOCR值会随着蛋白尿的减少而降低，并且高UPOCR表达者往往会有较高的尿蛋白/肌酐比值，并在疾病的活动期、急性期表现尤为显著。这标志着尿Nephrin、Podocin等足细胞相关分子的检测可以作为糖尿病肾病的早期生物学标志物。

中医古籍关于糖尿病有较多描述，《素问》首称其为消渴病，日久兼见“肺痨”“雀盲”“痈疽”“水肿”“关格”等并发症。其中“水肿”“尿浊”“关格”等与糖尿病肾病的表现尤为相近。笔者结合临床治疗经验与各家中医见解，认为糖尿病日久损及肾脏，病机以气阴两虚为本，兼夹水湿、浊毒、瘀血等病邪，发展至糖尿病肾脏病期，肾络瘀阻既为发病之故，又为病久之果，因此在治疗上更加注重滋补肾阴，益气活血通络，并总结出基础方剂保肾方Ⅱ号，由生黄芪、生地黄、丹参、女贞子、水蛭等组成，保肾通络方是在保肾方Ⅱ号基础上加用虫类药(蝉蜕、地龙、全蝎)组方而成，DN病程较长，缠绵难愈，根据中医理论，久病入络，久病必瘀，故DN患者往往存在肾络瘀滞。现代医学从肾脏病理角度已证实了肾络瘀滞的存在，如肾小球硬化、间质纤维化、肾小球及小动脉内微血栓形成等均可认为是肾络瘀滞的表现，所以很多医家已形成共识，活血化瘀应贯穿糖尿病肾病治疗的始终。而入络成瘀，一般草木类药物不能到达病所，唯用虫类药疏络剔邪，才能松动病根，所以从肾络瘀滞角度来看，应用虫类药治疗DN符合其中医病机特点。现代药理研究也证实虫类药多具有调节免疫、抗炎、抗组胺、改善高凝状态等作用，能针对上述因素而发挥作用。保肾通络方以生地黄、黄芪为君药益气滋阴，联合党参、枸杞子增强养阴益气之功，三棱、鬼箭羽活血化瘀，配合水蛭、蝉蜕、地龙、全蝎、虫蚁通络，全方攻补兼施，扶正祛邪，经临床及实验研究证明疗效确切[15-16]。课题组前期研究发现，保肾方Ⅱ号可有效降低糖尿病肾病大鼠尿白蛋白排泄率，上调MMP-2、TIMP-2的表达，在一定程度上改善肾功能及肾脏病理的进展。临床研究则发现应用保肾方Ⅱ号治疗糖尿病肾病患者，可在降低蛋白尿，改善临床症状的同时有稳定血糖，减少胰岛素用量的优势。临床观察同时发现：虫类药具有益肾固本、祛风散邪、清热利湿、活血化瘀的作用，其配合健脾补肾、活血益气药物可明显改善慢性肾炎患者症状，减少蛋白尿，安全性好[17]。

本研究通过腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病动物模型，在对比蛋白尿的同时，比较尿Nephrin、Podocin排泄，发现模型组大鼠尿微量白蛋白、Nephrin、Podocin的排泄率均明显增加。对早期糖尿病肾病的及时发现、糖尿病患者检测指标的完善有进一步指导意义。通过不同剂量的保肾通络方治疗后，大鼠尿Nephrin的排泄率明显低于模型组，其中中药中剂量虽然与其他剂量组相比差异无统计学意义，但效果呈现较优趋势，不除外低剂量药效不够，高剂量组浓度较高加重肾脏负担可能。虽然UACR与UPOCR的水平与模型组相比无统计学差异，但是呈现下降趋势，考虑治疗时间较短的缘故，同时也与糖尿病肾病尿Nephrin的排泄先于白蛋白出现这一结论相符。相关性分析显示UACR与UNECR、UPOCR呈正相关，推测糖尿病尿白蛋白的增加与Nephrin、Podocin蛋白从尿中丢失相关。虽然控制血糖是治疗糖尿病肾病的重要手段，但以上研究提示调节Nephrin、Podocin，降低蛋白尿也可作为中药保护肾脏的靶点之一，该保护作用可能与血糖、尿糖的降低无绝对关系。同时也为尿足细胞的测定作为糖尿病肾病生物学标志提供了有力的证据。

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